I. NGUYÊN LÝ

Fucsin basic và para andehit sẽ tạo thành phẩm nhuộm màu đỏ tía khi có mặt của axit vô cơ. Phẩm này được gọi là “andehit fucsin”, có khả năng nhuộm sợi chun, dưỡng bào, tế bào B của tụy nội tiết. Khi có mặt axit clohydric, para andehit sẽ giải trùng hợp tạo thành acetandehit và bị ngưng tụ lại khi gặp nhóm amino tự do của fucsin basic để tạo thành bazơ Schiff (azomethine). Phản ứng andehit fucsin với các thành phần mô là do liên kết cộng hóa trị hoặc liên kết tĩnh điện. Khả năng nhuộm rất mạnh cho các mô anion, chẳng hạn như mô có chứa gốc sunfonat tự do là do cơ chế ion. Hiện nay, cơ chế nhuộm sợi chun hoặc tế bào B của tụy nội tiết vẫn còn chưa sáng tỏ.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 02

2. Phương tiện, hóa chất

2.1. Phương tiện, hóa chất chung

- Nguồn cấp nước chảy.            

2.2. Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật

- Dung dịch permanganat kali 1%.

- Dung dịch axit oxalic 1%.

- Thuốc nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây): fucsin basic, para andehit, axit clohydric.

- Thuốc nhuộm hoặc eosin hoặc van Gieson hoặc đỏ trung tính.

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Cố định

Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.

Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

2. Chuyển bệnh phẩm

3. Vùi parafin

4. Đúc khối parafin

5. Cắt và dán mảnh cắt

6. Nhuộm mảnh cắt

6.1. Chuẩn bị phẩm nhuộm

Hòa tan 1g fucsin basic trong 100 ml etanol 70%. Hâm nóng để làm tăng tốc độ phản ứng. Sau khi làm lạnh và lọc, thêm 1ml axit clohydric đậm đặc và 2 ml para andehit. Để ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày nhằm hoàn thiện quá trình chín (dấu hiệu chín: dung dịch chuyển từ màu đỏ sang đỏ tía). Có thể làm giảm thời gian chín bằng cách tăng nhiệt độ tới 50-60 độ C. Sau khi dung dịch chín, lưu trữ bằng cách để trong tủ lạnh.

Khả năng nhuộm tốt nhất của aldehyde fucsin vào khoảng 2-4 ngày sau khi chuẩn bị dung dịch. Tuy nhiên, nếu để lưu trữ trong lạnh 4 độ C, dung dịch vẫn có thể hoạt động tốt trong vài tuần.

6.2. Tiến hành kỹ thuật

1. Tẩy parafin các mảnh cắt bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút

2. Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút

3. Rửa trong nước cất 3- 5 phút

4. Oxy hoá trong permanganat kali 1% x 5 phút.

5. Rửa dưới vòi nước chảy.

6. Loại permanganat kali bằng dung dịch axit oxalic 1%.

7. Rửa dưới vòi nước chảy.

8. Rửa trong etanol 70 độ.

9. Đặt mảnh cắt vào trong bể (lọ) đựng andehit fucsin được đậy kín x 15 phút.

10. Rửa kỹ trong etanol 70 độ.

11. Rửa dưới vòi nước chảy.

12. Nhuộm tương phản (đối màu) theo ý muốn (hoặc eosin, hoặc van Gieson, hoặc đỏ trung tính).

13. Khử nước bằng cồn 95° và 100°

14. Làm trong bằng 3 bể toluen sạch

15. Gắn lá kính

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Sợi chun: Xanh da trời - tía đỏ.

Kỹ thuật này cũng được sử dụng để nhuộm phát hiện các hạt trong tế bào Beta của tuỵ, một số chất nhầy, nấm, chất cơ bản sụn.

V. MỘT SỐ SAI SÓT VÀ CÁCH XỬ TRÍ

Độ tương phản giữa các sợi chun mảnh với sợi keo không được rõ ràng, nếu nhuộm đối màu bằng van Gieson. Tuy nhiên, nếu chỉ dùng để đối màu cho nhân thì vẫn thích hợp khi dùng van Gieson.