Hệ thống thông tin Sức khỏe Việt

Phát hiện sự thay đổi trình tự nucleotide liên quan đến kháng thuốc của virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human Immmunodeficiency Virus - HIV) trong huyết thanh hoặc huyết tương.

2. Nguyên lý

Xác định sự thay đổi trình tự nucleotide liên quan đến kháng thuốc của HIV bằng kỹ thuật giải trình tự gen.

Chuẩn bị

1. Người thực hiện

- Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

2.1. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp 2.

- Máy PCR

- Máy điện di

- Máy đọc điện di

- Máy giải trình tự gen

- Máy ly tâm 25000 x g

- Máy ly tâm cho tube 0,2 ml

- Máy ủ nhiệt

- Máy vortex

- Bộ lưu điện

- Tủ lạnh 2 oC - 8 oC

- Tủ âm sâu (-20 oC hoặc -70 oC)

- Micropipette

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần.

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị	Số lượng
1	Bông	kg	0,001
2	Cồn	ml	1,000
3	Bơm kim tiêm	Cái	1,000
4	Panh	Cái	0,0001
5	Khay đựng bệnh phẩm	Cái	0,0001
6	Hộp vận chuyển bệnh phẩm	Test	0,001
7	Tube đựng bệnh phẩm	Cái	2,000
8	Găng không có bột	Cái	0,500
9	Sinh phẩm chẩn đoán	Test	1,000
10	Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng	Test	1,350
11	Kit tách chiết RNA từ virus	Test	2,350
12	Primer 1 (primer đặc hiệu)	ml	0,0001
13	Primer 2 (primer đặc hiệu)	ml	0,0001
14	Primer 3 (primer đặc hiệu)	ml	0,0001
15	Primer 4 (primer đặc hiệu)	ml	0,0001
16	Ống Eppendorf 1,5 ml	Tube	3,000
17	Ống Eppendorf 0,2 ml	Tube	1,000
18	Đầu côn 10 µl có lọc	Cái	1,000
19	Đầu côn 30 µl	Cái	1,200
20	Đầu côn 200 µl có lọc	Cái	2,200
21	Đầu côn 1 ml có lọc	Cái	3,200
22	Ethanol BDH	ml	0,500
23	Water-DEPC Treated	ml	2,000
24	Thạch	Gam	0,075
25	Ladder	ml	0.0025
26	Blue Juice Gel loading dye	ml	0.003
27	Ethidium Bromide	ml	0.100
28	TAE Buffer	ml	0.100
29	Giấy thấm	Cuộn	0,100
30	Giấy xét nghiệm	Tờ	2,000
31	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ	0,001
32	Bút viết kính	Cái	0,020
33	Bút bi	Cái	0,010
34	Mũ	Cái	0,020
35	Khẩu trang	Cái	0,020
36	Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi	0,020
37	Quần áo bảo hộ	Bộ	0,005
38	Dung dịch nước rửa tay	ml	8,000
39	Cồn sát trùng tay nhanh	ml	1,000
40	Dung dịch khử trùng	ml	10,000
41	Khăn lau tay	cái	0,010
42	Ngoại kiểm (nếu có)*		0,020

* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Huyết thanh, huyết tương

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

1. Lấy bệnh phẩm

- Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: xem chi tiết phụ lục 3.

- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: xem chi tiết phụ lục 6.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Tách chiết RNA tổng số

2.2. Thực hiện RT-PCR

2.3. Điện di kiểm tra sản phẩm

2.4. Giải trình tự gen

2.5. Kiểm tra và phân tích trình tự gen kháng thuốc của HIV trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự DNA của gen đích không bị nhiễu và phải cho thấy có sự thay đổi một số vị trí nucleotide trên gen tương ứng với các loại thuốc điều trị HIV

Tai biến và xử trí

-Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết RNA tổng số, chất lượng primers và master mix, và thực hiện lại xét nghiệm.

- Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.