Hệ thống thông tin Sức khỏe Việt

Xác định trình tự nucleotide đặc trưng cho từng genotype của Enterovirus 71 (EV 71) trong các loại dịch tiết đường hô hấp, các loại dịch khác và phân.

2. Nguyên lý

Xác định trình tự nucleotide đặc trưng cho từng genotype của EV71 bằng kỹ thuật giải trình tự gen.

Chuẩn bị

1. Người thực hiện

- Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

2.1. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Máy PCR

- Máy điện di

- Máy đọc điện di

- Máy giải trình tự gen

- Máy ly tâm 25000 x g

- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

- Máy ủ nhiệt

- Máy vortex

- Bộ lưu điện

- Tủ lạnh 2 oC - 8 oC

- Tủ âm sâu (-20 oC hoặc -70 oC)

- Micropipette

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị	Số lượng
1	Bông	kg	0,001
2	Cồn	ml	1,000
3	Bơm kim tiêm	Cái	1,000
4	Panh	Cái	0,0001
5	Khay đựng bệnh phẩm	Cái	0,0001
6	Hộp vận chuyển bệnh phẩm	Test	0,001
7	Tube đựng bệnh phẩm	Cái	2,000
8	Găng không có bột	Cái	0,500
9	Sinh phẩm chẩn đoán	Test	1,000
10	Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng	Test	1,350
11	Kit tách chiết RNA từ virus	Test	2,350
12	DNA marker	Bộ	1,000
13	Primer 1 (primer đặc hiệu)	ml	0,0001
14	Primer 2 (primer đặc hiệu)	ml	0,0001
15	Primer 3 (primer đặc hiệu)	ml	0,0001
16	Primer 4 (primer đặc hiệu)	ml	0,0001
17	Ống Eppendorf 1,5 ml	Tube	3,000
18	Ống Eppendorf 0,2 ml	Tube	1,000
19	Đầu côn 10 µl có lọc	Cái	1,000
20	Đầu côn 30 µl	Cái	1,200
21	Đầu côn 200 µl có lọc	Cái	2,200
22	Đầu côn 1 ml có lọc	Cái	3,200
23	Ethanol BDH	ml	0,500
24	Water-DEPC Treated	ml	2,000
25	Thạch	Gam	0.075
26	Ladder	ml	0.0025
27	Blue Juice Gel loading dye	ml	0.003
28	Ethidium Bromide	ml	0.100
29	TAE Buffer	ml	0.100
30	Giấy thấm	Cuộn	0,100
31	Giấy xét nghiệm	Tờ	2,000
32	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ	0,001
33	Bút viết kính	Cái	0,020
34	Bút bi	Cái	0,010
35	Mũ	Cái	0,020
36	Khẩu trang	Cái	0,020
37	Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi	0,020
38	Quần áo bảo hộ	Bộ	0,005
39	Dung dịch nước rửa tay	ml	8,000
40	Cồn sát trùng tay nhanh	ml	1,000
41	Dung dịch khử trùng	ml	10,000
42	Khăn lau tay	cái	0,010
43	Ngoại kiểm (nếu có)*		0,020

* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Dịch hầu họng, dịch đường hô hấp, phân, và các loại dịch khác…

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

Các bước tiến hành

1. Người thực hiện

- Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

2.1. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Máy PCR

- Máy điện di

- Máy đọc điện di

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự DNA của gen đích không bị nhiễu và phải có độ tương đồng ≥ 90 % mới có thể kết luận được genotype của EV71

- Máy giải trình tự gen

- Máy ly tâm 25000 x g

- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

- Máy ủ nhiệt

- Máy vortex

- Bộ lưu điện

- Tủ lạnh 2 oC - 8 oC

- Tủ âm sâu (-20 oC hoặc -70 oC)

- Micropipette

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị	Số lượng
1	Bông	kg	0,001
2	Cồn	ml	1,000
3	Bơm kim tiêm	Cái	1,000
4	Panh	Cái	0,0001
5	Khay đựng bệnh phẩm	Cái	0,0001
6	Hộp vận chuyển bệnh phẩm	Test	0,001
7	Tube đựng bệnh phẩm	Cái	2,000
8	Găng không có bột	Cái	0,500
9	Sinh phẩm chẩn đoán	Test	1,000
10	Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng	Test	1,350
11	Kit tách chiết RNA từ virus	Test	2,350
12	DNA marker	Bộ	1,000
13	Primer 1 (primer đặc hiệu)	ml	0,0001
14	Primer 2 (primer đặc hiệu)	ml	0,0001
15	Primer 3 (primer đặc hiệu)	ml	0,0001
16	Primer 4 (primer đặc hiệu)	ml	0,0001
17	Ống Eppendorf 1,5 ml	Tube	3,000
18	Ống Eppendorf 0,2 ml	Tube	1,000
19	Đầu côn 10 µl có lọc	Cái	1,000
20	Đầu côn 30 µl	Cái	1,200
21	Đầu côn 200 µl có lọc	Cái	2,200
22	Đầu côn 1 ml có lọc	Cái	3,200
23	Ethanol BDH	ml	0,500
24	Water-DEPC Treated	ml	2,000
25	Thạch	Gam	0.075
26	Ladder	ml	0.0025
27	Blue Juice Gel loading dye	ml	0.003
28	Ethidium Bromide	ml	0.100
29	TAE Buffer	ml	0.100
30	Giấy thấm	Cuộn	0,100
31	Giấy xét nghiệm	Tờ	2,000
32	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ	0,001
33	Bút viết kính	Cái	0,020
34	Bút bi	Cái	0,010
35	Mũ	Cái	0,020
36	Khẩu trang	Cái	0,020
37	Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi	0,020
38	Quần áo bảo hộ	Bộ	0,005
39	Dung dịch nước rửa tay	ml	8,000
40	Cồn sát trùng tay nhanh	ml	1,000
41	Dung dịch khử trùng	ml	10,000
42	Khăn lau tay	cái	0,010
43	Ngoại kiểm (nếu có)*		0,020

3. Bệnh phẩm

Dịch hầu họng, dịch đường hô hấp, phân, và các loại dịch khác…

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

Tai biến và xử trí

- Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết RNA tổng số, chất lượng primers và master mix, và thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.

- Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.