Hệ thống thông tin Sức khỏe Việt

Kỹ thuật phân nhóm vi khuẩn M. tuberulosis - Restriction fragement length polymophism (RFLP) dựa trên phương pháp lai phân tử với mẫu dò đặc hiệu với DNA của vi khuẩn lao được cố định trên màng lai. Tính đa hình về kích thước tạo ra do sự khác biệt về số lượng bản sao và vị trí của các đoạn IS6110 trên nhiễm sắc thể vi khuẩn cho phép phân loai M.tuberculosis thành các nhóm nhỏ.

Trên nhiễm sắc thể Mycobacterium tuberculosis có các đoạn IS6110. Trên đoạn IS6110 có các vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn, đồng thời ngoài đoạn IS6110 cũng có các vị trí cắt giới hạn tương ứng. Sử dụng enzyme cắt giới hạn chia bộ gene vi khuẩn thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau. Số lượng bản sao IS6110 khác nhau cho ta số đoạn cắt khác nhau. Điện di, chuyển DNA lên màng lai, lai với mẫu dò đặc hiệu để phát hiện số lượng và kích thước các đoạn cắt.

Chuẩn bị

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

1. Người thực hiện

- Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất

2.1. Trang thiết bị

- Tủ ATSH cấp II	- Cân điện tử
- Máy siêu ly tâm tuýp 1.5ml	- Pipette tự động 10, 200, 1000µl.
- Máy ly tâm mini (Spin down)	- Panh, kẹp (Forceps
- Máy ủ nhiệt khô/ướt	- Tủ sấy
- Máy siêu âm (Ultrasonic)	- Nồi hấp khử trùng
- Máy nhân gene	- Tủ thao tác PCR
- Lò vi sóng (Microwave Oven)	- Đồng hồ hẹn giờ
- Bộ điện di	- Hộp giữ lạnh
- Máy vortex	- Lò lai DNA
- Máy lắc ngang	- Hộp ủ phim X-ray
- Tủ lạnh 4o /- 20o/-80o	- Hộp rửa phim
- Hệ thống chụp ảnh điện di Pringraph	- Hệ thống US Stralinker
- Hệ thống Vacuum Blotter	- Hệ thống Gel Documentation
- Máy đo nồng độ DNA Spec™ Plus

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị	Số lượng
I	Hóa chất
1	Protein K	µl	10,000
2	SDS	gam	0,500
3	TE buffer	ml	5,000
4	Lysozym	mg	0,010
5	Chloroform	ml	0,500
6	Alcohol	ml	0,500
7	Isopropanol	ml	0,500
8	Ethanol	ml	0,500
9	CTAB	gam	0,200
10	NaCL	gam	0,500
11	Sodium acetat	gam	0,500
12	TAE buffer	ml	5,000
13	Hybridization buffer solution	ml	5,000
14	SSC buffer stock solution 20 X	ml	1,000
15	ECL Direct Nucleic Acid Labelling System	ml	0,200
16	ECL Detection Reagents	ml	0,200
17	Hot start TagDNA polymerase	µl	0,500
18	100 bp DNA ladder	µl	0,500
19	(CGG)5 primer	µl	0,500
20	LightCycler FastStart DNA MasterplusHybprobe	gam	0,100
21	Pvu II	µl	0,300
22	Alu I	µl	0,300
23	Primer INS 1, 2	µl	0,300
25	SeaKem Gold agarose	gam	0,100
26	Agarose	gam	0,100
27	Ethidium Bromid	ml	0,050
28	Streptavidin - POD- Conjugate	ml	0,500
29	Standard chemical for pH metter	ml	0,500
30	Nước tinh sạch ( pha PCR Mix )	ml	0,500
31	Nước cất hai lần ( pha buffer )	lít	0,500
II	Vật tư tiêu hao
32	Đầu côn 10 µl	cái	3,000
33	Đầu côn 100 µl	cái	4,000
34	Đầu côn 1000 µl	cái	3,000
35	Eppendorf 0,2 ml	cái	2,000
36	Eppendorf 1,5 ml	cái	1,000
37	Cryotube 1.5 ml	cái	1,000
38	Giấy tráng kim	Hộp	0,01
39	Capillary(20mcl)	cái	1,000
40	Màng hybbond	cái	0,100
41	Plastic Wrap	Hộp	0,050
42	Găng tay	đôi	1,000
43	Khẩu trang N95	cái	1,000
44	Khăn giấy	cuộn	0,020
45	Cồn 70°	ml	10,000
46	Bút MARKER	cái	0,010

3. Bệnh phẩm

Thực hiện xét nghiệm phân nhóm M. tuberculosis cho các bệnh phẩm là chủng vi khuẩn lao mọc trên môi trường đặc.

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

Các bước tiến hành

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 2)

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Lập danh sách, cập nhập thông tin mẫu cần xét nghiệm.

2.2. Xử lý mẫu theo danh sách đã trích lọc

2.3. Tách chiết DNA vi khuẩn theo quy trình chuẩn

2.4. Chuẩn bị thang DNA và mẫu dò IS6110

2.5. Thực hiện phản ứng cắt bằng Enzyme cắt giới hạn

2.6. Ước lượng/đo nồng độ DNA sau phản ứng cắt

2.7. Điện di DNA

2.8. Xử lý gel sau khi điện di

2.9. Chuyển DNA lên màng lai

2.10. Lai với ECL kít

2.11. Rửa màng sau khi lai

2.12. Phát hiện tín hiệu lai bằng ECL

2.13. Đọc và phân tích kết quả

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Tín hiệu lai được thể hiện bằng những vach màu đen trên phim. Scan các phim này vào máy tính và phân tích bằng chương trình Bionumerics. Sau khi chuẩn hóa các phim, dựa trên hình ảnh các băng vạch, các mẫu chủng sẽ được so sánh với nhau và so với mẫu chuẩn để phân nhóm chủng M. tuberculosis.

Trong một số trường hợp khó nhận biết các băng vạch với nhau nên đôi khi kết quả không đồng nhất, cần lặp lại xét nghiệm để xác định kết quả.

Hình 2. Kết quả RFLP được phân tích bằng Bionumerics

Tai biến và xử trí

Lỗi	Giải thích và cách Xử lý
Không có tín hiệu lai được phát hiện	- Kiểm tra thiết bị, hóa chất, nhiệt độ. - Enzym đã bất hoạt. Chia nhỏ lượng enzym, bảo quản theo đúng điều kiện cần thiết và sử dụng hộp giữ lạnh khi pha mix. - Điện di 5 µl sản phẩm PCR trên thạch Agarose 2% để kiểm tra quá trình nhân gene có thang DNA hay không. - Enzym cắt mất hoạt tính - Hóa chất ủ phim ECL hết hạn - Kiểm tra quá trình thấm DNA lên màng
Ảnh điện di không đặc hiệu, các đoạn cắt không rõ ràng	- Quá trình tách DNA chưa tốt. DNA không tinh sạch, lẫn nhiều protein. - Enzyme cắt giới hạn (RE) cần được bảo quản tốt trong dung dịch đệm có 50% glycerol ở -20 oC. - Khi thực hiện phản ứng cắt bằng RE, cần sử dụng nồng độ NaCl của dung dịch đệm từ thấp đến cao. - Tối ưu hiệu quả hoạt động của Enzyme cắt giới hạn, đảm bảo thể tích RE không quá 1/10 thể tích phản ứng
Các yếu tố khác ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm	- Nhiệt độ ủ sai. Dung dịch lai và nước rửa không được ủ ấm trước khi thực hiện. - Nhiễm DNA trong bước tách chiết hoặc/và trong hóa chất sử dụng. - Tín hiệu lai không đều. ECL quá hạn hoặc ECL không được láng đều trên toàn bộ bề mặt của màng lai. - Đánh số, mã đánh dấu lên màng DNA bằng bút bi để phân biệt các file trên hệ thống máy tính.