1. Mục đích

Xác định DNA đặc trưng của Chlamydia

2. Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

1. Người thực hiện

- Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

2.1. Trang thiết bị

- Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

- Bộ lưu điện

- Máy ủ nhiệt

- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

- Máy ly tâm 25000 x g

- Tủ lạnh 2 oC -8 oC

- Tủ âm sâu (-20 oC) hoặc (-70 oC) (nếu có)

- Máy vortex

- Tủ an toàn sinh học

- Micropipettes các thể tích từ 5 ml - 1000 ml.

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 3 mẫu/lần thực hiện (VD)

* Ghi chú:

- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Dịch niệu đạo, dịch âm đạo, nước tiểu, dịch vết loét

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 3).

2. Tiến hành kỹ thuật

Bộ sinh phẩm CHT rPCR Mix (VD)

2.1. Thu nhận và Xử lý mẫu

Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA

2.2. Tách chiết DNA: Tách chiết bằng hóa chất phenol/chloroform

2.3. Thực hiện phản ứng real-time PCR

- Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

- Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cầnTrước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

- Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube CHT rPCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.

- Bật máy real-time PCR. Bật máy tính và chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chương trình real-time PCR lên.

- Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

- Chọn màu “FAM” và “HEX” và “CY5” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.

- Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động

- Lưu file dữ liệu vào máy tính

- Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1. Điều kiện của phản ứng

- Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM và màu HEX tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu CY5 dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính).

- Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM và màu HEX âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu CY5 dương tính

2. Phân tích mẫu

- Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng tương ứng với màu của từng tác nhân và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước. Một mẫu có thể dương tính với 1 trong 2 tác nhân hoặc dương tính đồng thời cả 2 tác nhân.

- Mẫu nghi ngờ: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu từ sau chu kỳ 36 → đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hiện lại xét nghiệm sau 1-3 tháng.

- Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.

3. In đồ thị kết quả

. Sự cố: Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

2. Nguyên nhân: Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.

3. Khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.