Là kỹ thuật làm tiêu bản và phương pháp nhuộm để phát hiện các bất

thường của tổ chức hạch, lách, tñy x-¬ng giúp chẩn đoán các bệnh lý tủy xương

liên quan.

1. Người thực hiện

01 Kỹ thuật viên hoặc cử nhân kỹ thuật chuyên khoa Huyết học  Truyền

máu.

2. Phương tiện – Hóa chất

2.1 Dụng cụ

- Máy cắt tiêu bản;

- Bàn sấy 37oC;

- Kính hiển vi quang học;

- Bể nhuộm tiêu bản dung tích 100ml: 06 chiếc;

- Bể nhuộm tiêu bản dung tích 200ml: 06 chiếc;

- Giá cài tiêu bản vừa bể nhuộm 200ml: 01 chiếc;

- Giá gỗ cài tiêu bản: 02 chiếc;

- Pipette Pasteur: 04 chiếc;

- Gạc thấm nước: 03 chiếc;

- Bút chì hoặc bút viết kính: 01 chiếc;

- Lamen 22 x 24 hoặc 22 x 22.

2.2 Hóa chất

- Toluen 1,2,3: để sẵn trong 3 bể nhuộm 100ml;

- Cồn tuyệt đối Etylic 1,2,3 để sẵn trong bể nhuộm 100ml;

- Cồn 80o pha sẵn và để trong bể 100ml;

- Dung dịch Hematoxylin (thành phẩm): để sẵn trong bể 200 ml;

- Dung dịch Erythrosin: để sẵn trong bể nhuộm 200 ml;

- Axit HCL %: Để trong bể nhuộm 200 ml;

- Boom Canada: Lấy ra cốc nhỏ, để trong tủ 60oC.

Cách pha hóa chất

Dung dịch Erythrosin

Erythrosin B (C20H6I4Na2O5): 0,1g57

Nước cất: 100ml

Khuấy đều ta được dung dịch Erythrosin B(C20H6I4Na2O5) nồng độ 1‰

Dung dịch Hematoxylin: là hóa chất thành phẩm có trên thị trường.

Dung dịch Hemalun demayer

Công thức:

 Alunde K(KAl(SO4)2.12H2O): 5g

 Hematine(C6H12O6): 300mg

 Acid Acetic(CH3COOH): 5ml

 Nước cất: 250ml

Cách pha:

Đun sôi nước cho Alunde K.(KAl(SO4)2.12H2O) vào đun tiếp khoảng

12 phút cho tan hết, sau đó cho tiếp Hematine (C6H12O6), đun thêm 1 phút và

tắt bếp bắc ra để nguội  cho tiếp Acid Acetic (CH3COOH) vào ta được dung

dịch Hemalun demayer.

Dung dịch Na2S2O3 5%

 Na2S2O3: 5g

 Nước cất: 100ml

Lắc đều cho tan hÕt Na2S2O3 sẽ được dung dịch Na2S2O3 5%:

Dung dịch Na2CO3 1%

 Na2CO3: 1g

 Nước cất: 100ml

Trộn dung môi và chất tan lẫn nhau, sau đó lắc đều cho tan hết Na2CO3 ta

được dung dịch cần pha.

Dung dịch Lugol

Công thức:

 KI: 2g

 Iôt tinh thể: 1g

 Nước cất: 100ml

Cách pha:

Cho KI hòa tan trong nước trước sau đó cho tiếp Iốt tinh thể vào, khuấy

đều cho đến khi tan hết ta được dung dịch Lugol.58

3. Bệnh phẩm

Là các tiêu bản mảnh sinh thiết đã cắt sẵn, đảm bảo khô: Sau khi mảnh

sinh thiết được đúc thành khuôn, tiến hành cắt dán trên lam kính và để khô trong

tủ ấm 37oC trong 3 giờ.

4. Phiếu xét nghiệm

1. Quy trình xử lý bệnh phẩm sinh thiết

- Cố định mảnh sinh thiết trong dung dịch (DD) Formol 10% trong 24 giờ;

- Chuyển trong hóa chất:

+ Rửa mẫu trong nước chảy nhẹ trong 1 giờ;

+ Đẩy nước bằng ngâm trong cồn;

Ngâm trong cồn 90o: 30 phút;

Ngâm trong cồn tuyệt đối I: 1 giờ;

Ngâm trong cồn tuyệt đối II: 1 giờ;

Ngâm trong cồn tuyệt đối II: 3 giờ;

- Loại cồn bằng Xylen →lấy mảnh sinh thiết thấm khô bằng giấy thấm

Ngâm trong Xylen I: 30 phút;

Ngâm trong Xylen II: 1 giờ;

Ngâm trong Xylen III: 1 giờ;

- Vùi mẫu trong parapin và đúc khuôn.

Lấy mẫu từ Xylen III và thấm khô bằng giấy thấm.

Ngâm trong Parafin nóng chảy trong 12 giờ.

Đúc mảnh sinh thiết trong khuôn Parafin nóng chảy.

Bảo quản khuôn mảnh sinh thiết trong ngăn tủ mát (2oC-8oC)

2. Nhuộm Giemsa mảnh sinh thiết

- Cắt dán tiêu bản và để khô trong tủ 37oC trong 2 giờ;

- Tẩy Parafin bằng cách chuyển mẫu qua Toluen I,II,III → cồn tuyệt đối

I,II và cồn 80oC. Mỗi loại 5 phút;

- Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ: 5 phút;

- Tráng qua cồn tuyệt đối;

- Nhuộm Giemsa 1/10: 15 phút;

- Rửa dưới nước chảy nhẹ;

- Đẩy nước bằng cồn tuyệt đối ngâm trong Toluen;

- Gắn lamen và để khô.59

3. Nhuộm HE mảnh sinh thiết h¹ch, l¸ch.

- Tẩy parafin bằng cách chuyển mẫu qua Toluen I, II, III  cồn 80o, cồn

tuyệt đối I, II: Mỗi loại 5 phút;

- Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút;

- Nhuộm trong Hematoxylin: 2  5 phút;

- Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút;

- Tẩy qua axit HCL 1%: 4-8 giây (nếu cần);

- Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút;

- Nhuộm trong Erythrosin: 30 - 60 giây;

- Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút;

- Đẩy nước bằng cồn tuyệt đối  ngâm tiêu bản trong Toluen;

- Gắn lamen, để khô và nhận định kết quả.

4. Nhuộm HE mảnh sinh thiết tñy x-¬ng

- Chuyển xylen 1,2,3, cồn 1,2 và cồn 80o mỗi loại 5 phút;

- Rưả dưới dòng nước chảy 10 phút và rửa sạch paraphin;

- Nhuộm Lugol :10 phút;

- Rửa nước chảy:10 phút;

- Nhuộm Na2S2O3: 5 phút;

- Rửa dưới dòng nước chảy:10 phút;

- Nhúng vào Hemlundemaye: 4 phút;

- Rửa nước chảy:10 phút;

- Tẩy cồn HCL 1 % 8 giây;

- Rửa dưới dòng nước chảy 10 phút (nước có sẵn trong cóng);

- Làm xanh tiêu bản bằng Na2CO3 :1 phút;

- Rửa dưới dòng nước chảy:10 phút;

- Nhúng nền bằng Erythrosin: 2 4 giây;

- Rửa nước chảy 5 phút;

- Gắn lamen: rửa sạch tiêu bản, tráng lại bằng nước cất, tẩy nước bằng

cồn tuyệt đối, nhúng qua xylen 1,2,3 (đã để trong tủ ấm) và gắn lamen.

- Nhuộm các thì hóa chất không phù hợp

- Hóa chất đã bị thay đổi nồng độ.