Các bài viết liên quan
- Virus PCR
- Norovirus test nhanh
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) kháng thuốc Bedaquiline MIC trên môi trường thạch
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) kháng thuốc MIC trên môi trường lỏng
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) định danh TB-LAMP
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) kháng INH nồng độ cao môi trường lỏng
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) định danh TRCReady
- Vi sinh vật nhiễm khuẩn đường ruột Real-time PCR đa tác nhân
- Vi sinh vật nhiễm khuẩn hô hấp Real-time PCR đa tác nhân
- Vi sinh vật nhiễm khuẩn não-màng não Real-time PCR đa tác nhân
NTM (Nontuberculous mycobacteria) định danh Real-time PCR
Quyết định số: 6769/QĐ-BYT
Ngày ban hành: 08/11/2018 12:00
Đại cương
1. Mục đích
Xác định DNA đặc trưng của NTM (Nontuberculous mycobacteria) trong mẫu bệnh phẩm của người.
2. Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.
Chuẩn bị
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)
2.1. Trang thiết bị
- Máy real-time PCR đa màu và hệ thống máy vi tính.
- Bộ lưu điện
- Máy ủ nhiệt
- Máy ly tâm > 12000 gpm/phút
- Máy ly tâm lạnh
- Tủ lạnh 2°C -8°C
- Tủ âm sâu (-20° C) hoặc (-70°C) (nếu có)
- Máy vortex
- Tủ an toàn sinh học
- Micropipettes các thể tích từ 5 μl - 1000 μl.
- Đầu côn có phin lọc các thể tích từ 5 μl - 1000 μl.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
STT | Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao | Đơn vị |
| 1. | Lọ đựng bệnh phẩm vô trùng | Cái |
| 2. | Khay đựng bệnh phẩm | Cái |
| 3. | Hộp vận chuyển bệnh phẩm | Cái |
| 4. | Găng không có bột tal (DNase-RNase free) | Đôi |
| 5. | Sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chẩn đoán | Test |
| 6. | Khấu hao sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng | Test |
| 7. | Hóa chất và vật tư tiêu hao cho tách acid nucleic | Test |
| 8. | Tube eppendorff 1,5 ml | Cái |
| 9. | Strip 8 tubes 0,1 ml | Cái |
| 10. | Nắp đậy strip 8 tubes | Cái |
| 11. | Đầu côn có phin lọc 1 ml | Cái |
| 12. | Đầu côn có phin lọc 200 μl | Cái |
| 13. | Đầu côn có phin lọc 10 μl | Cái |
| 14. | Giấy thấm không bụi | Cuộn |
| 15. | Giấy xét nghiệm | Tờ |
| 16. | Sổ lưu kết quả xét nghiệm | Tờ |
| 17. | Bút viết kính | Cái |
| 18. | Bút bi | Cái |
| 19. | Mũ | Cái |
| 20. | Khẩu trang | Cái |
| 21. | Găng tay xử lý dụng cụ | Đôi |
| 22. | Quần áo bảo hộ | Bộ |
| 23. | Dung dịch xà phòng rửa tay | ml |
| 24. | Cồn sát trùng tay nhanh | ml |
| 25. | Dung dịch khử trùng | ml |
| 26. | Khăn lau tay | Cái |
| 27. | Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)* |
|
* Ghi chú:
- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm
Đờm, các dịch sinh học (dịch phế quản, dịch não tủy, nước tiểu, phân...), mảnh sinh thiết...
4. Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.
2. Tiến hành kỹ thuật
Các bộ sinh phẩm (VD hoặc tương đương):
- ExiPrep™ Dx Mycobacteria Genomic DNA Kit (Bioneer).
- Accupower MTB & NTM Real-time PCR Kit (Bioneer)
2.1. Thu nhận và xử lí mẫu
Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA (nếu cần).
2.2. Tách chiết DNA, RNA
2.3. Thực hiện phản ứng real-time PCR
Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh
- Cài đặt chương trình cho máy real-time PCR trước khi pha hóa chất.
- Chuẩn bị Master Mix
- Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube Master Mix.
- Cài đặt vị trí mẫu trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
- Chọn các kênh màu phù hợp với từng tác nhân của mẫu, chứng dương và chứng âm.
- Lưu file dữ liệu vào máy tính
- Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
Tai biến và xử trí
1. Sự cố: Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
2. Nguyên nhân: Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.