1. Mục đích

Là quy trình phát hiện Mycobacterium tuberculosis complex từ ADN tách chiết của mẫu đờm của Người bệnh có triệu chứng nghi lao.

2. Nguyên lý

Quy trình dựa trên phản ứng nhân gen đẳng nhiệt, LAMP (loop- mediated Isothermal Amplication).

Phương pháp LAMP có các đặc tính sau:

- Chỉ 1 loại enzyme được sử dụng và phản ứng trong điều kiện đẳng nhiệt

- Độ đặc hiệu rất cao do bởi sử dụng 4 đoạn mồi nhận biết 6 vùng riêng biệt trên trình tự đích

- Hiệu quả khuếch đại cao cho phép thời gian khuếch đại ngắn

- Quy trình tạo ra 1 số lượng lớn sản phẩm nhân gen cho phép phát hiện bằng mắt thường

Các đoạn mồi được thiết kế dựa trên trình tự vùng gyrB và IS của vi khuẩn lao. 

Việc phát hiện ADN khuếch đại dựa trên độ đục của phản ứng và được quan sát dưới ánh sáng UV.

1. Người thực hiện:

- Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ xét nghiệm.

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

2.1. Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp I (nếu có) 

Pipét chuyên dụng của Loopamp 

Máy vortex

Máy trộn mẫu chuyên dụng của Loopamp

Máy PCR chuyên dụng của Loopamp (LF160) 

Tủ lạnh 2-8°C

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

*Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Là mẫu đờm nhày mủ, không lẫn máu, cặn thức ăn

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

1. Chuẩn bị mẫu

Phản ứng LAMP

- Đánh số trên mẫu bệnh phẩm và tuýp nhiệt, mỗi mẻ kèm theo một chứng âm.

- Dùng pipét chuyên dụng của hãng cung cấp hút 60 μl đờm hoặc cặn mẫu đờm đã xử lý bằng NALC-NaOH cho vào tuýp nhiệt.

- Tiến hành tuýp nhiệt ở 90°C (± 5°C), trước khi ủ lộn ngược tuýp vài lần.

2. Tách chiết ADN

- Để tuýp nhiệt nguội 3 phút, lộn ngược tuýp 3 lần.

- Lấy nắp tuýp hóa chất tách chiết ra khỏi thân để thẳng đứng vào giá và thay thế bằng tuýp ủ nhiệt, lắc thật mạnh đến tan (I).

- Chuẩn bị ống phản ứng LAMP (chuẩn bị đủ số mẫu và 1 chứng âm, 1 chứng dương)

- Lắp đầu lọc tách chiết ADN vào (I), bóp mạnh để thu ADN vào tuýp phản ứng LAMP (thể tích ADN nằm trong ngưỡng đánh dấu trên tuýp phản ứng).

- Sau mỗi mẫu đóng nắp tuýp, lặp lại với các ống tiếp theo.

- Chuyển toàn bộ các mẫu đã chuẩn bị và chứng dương lên máy lắc chuyên dụng trong 2 phút và Spindown mẫu 10 giây.

3. Phản ứng LAMP

- Chuyển mẫu vào máy PCR chuyên dụng LAMP, chạy phản ứng trong 40 phút tại 67°C (thêm 5 phút cuối 80°C).

- Nhấc tuýp ra khỏi máy PCR và đặt tuýp vào khay đọc kết quả huỳnh quang.

- Bật đèn và so sánh mức độ phát sáng của mẫu với chứng âm và chứng dương.

- Ghi chép lại kết quả xét nghiệm.

- Vệ sinh khu vực làm việc bằng Hypochlorit sodium 0,5% và làm sạch lại bằng nước cất hoặc cồn 70%.

Máy báo lỗi khi bệnh phẩm lẫn máu và thức ăn: sàng lọc kĩ bệnh phẩm trước khi làm xét nghiệm.