Các bài viết liên quan
- Virus PCR
- Norovirus test nhanh
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) kháng thuốc Bedaquiline MIC trên môi trường thạch
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) kháng thuốc MIC trên môi trường lỏng
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) định danh TB-LAMP
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) kháng INH nồng độ cao môi trường lỏng
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) định danh TRCReady
- Vi sinh vật nhiễm khuẩn đường ruột Real-time PCR đa tác nhân
- Vi sinh vật nhiễm khuẩn hô hấp Real-time PCR đa tác nhân
- Vi sinh vật nhiễm khuẩn não-màng não Real-time PCR đa tác nhân
Virus Real-time PCR
Quyết định số: 6769/QĐ-BYT
Ngày ban hành: 08/11/2018 12:00
Đại cương
1. Mục đích
Xác định DNA hoặc ARN đặt trưng của virus cần tìm.
2. Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.
Chuẩn bị
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)
2.1. Trang thiết bị
- Tủ an toàn sinh học cấp 2
- Máy nhiệt
- Máy ly tâm bàn dùng cho ống bệnh phẩm 5ml
- Máy ly tâm lạnh dùng cho tube 0,2 ml
- Máy vortex
- Máy chạy PCR
- Máy chạy Real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
- Các loại Micropipette điều chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl
- Tủ lạnh thường
- Tủ âm sâu (-20°C) hoặc (-70°C) (nếu có)
- Bộ lưu điện
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
STT | Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao | Đơn vị |
1 | Bông | Kg |
2 | Dây garô | Cái |
3 | Cồn | ml |
4 | Bơm kim tiêm | Cái |
5 | Panh | Cái |
6 | Khay đựng bệnh phẩm | Cái |
7 | Hộp vận chuyển bệnh phẩm | Test |
8 | Dụng cụ lấy bệnh phẩm (Ống chống đông 5ml có chứa EDTA/ Tăm bông vô trùng/ Tube đựng bệnh phẩm vô trùng) | Ống |
9 | Tube 1,5ml vô trùng | Tube |
10 | Găng không có bột (DNase-RNase free) | Đôi |
11 | Bộ kít chiết tách DNA/RNA tổng số | Hộp |
12 | Bộ kít tổng hợp cDNA (Nếu là virus RNA) | Hộp |
13 | Sinh phẩm chẩn đoán | Test |
14 | Khấu hao sinh phẩm cho mẫu chứng và kiểm tra chất lượng, standard các loại | Test |
15 | Ependoff 1,7ml | Tube |
16 | Ependoff 0,2ml | Tube |
17 | Đầu côn 10 µl có lọc | Cái |
18 | Đầu côn 30 µl có lọc | Cái |
19 | Đầu côn 200 µl có lọc | Cái |
20 | Đầu côn 1 ml có lọc | Cái |
21 | Water-DEPC Treated | ml |
22 | Giấy thấm không bụi | Cuộn |
23 | Giấy xét nghiệm | Tờ |
24 | Sổ lưu kết quả xét nghiệm | Tờ |
25 | Bút viết kính | Cái |
26 | Bút bi | Cái |
27 | Mũ | Cái |
28 | Khẩu trang | Cái |
29 | Găng tay xử lý dụng cụ | Đôi |
30 | Quần áo bảo hộ | Bộ |
31 | Dung dịch xà phòng rửa tay | ml |
32 | Cồn sát trùng tay nhanh | ml |
33 | Dung dịch khử trùng | ml |
34 | Khăn lau tay | Cái |
35 | Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)* |
|
* Ghi chú:
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm
Các loại bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm virus cần tìm
4. Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Thu nhận và xử lý mẫu:
- Tất cả loại bệnh phẩm khi chứa nhiều tạp nhiễm cần được thuần nhất trước khi tách chiết.
2.2. Tách chiết DNA hoặc RNA từ bệnh phẩm bằng bộ kit tách DNA tổng số hoặc RNA tổng số
2.3. Chạy phản ứng RT-PCR dùng mồi ngẫu nhiên với virus có bộ gen là RNA (Bỏ qua bước này nếu kít sử dụng real-time PCR có chứa luôn phản ứng RT-PCR)
- Bật máy PCR 15 phút trước khi chạy phản ứng RT-PCR
- Thực hiện bước này với các tube RT-PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
- Chỉ lấy đủ số tube RT-PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng RT-PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.
- Cho dịch RNA tách chiết vào từng tube RT-PCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy PCR.
- Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy PCR hoạt động theo hướng dẫn của bộ kit RT-PCR.
- Cho máy PCR chạy chương trình.
2.4 Chạy phản ứng Real-time PCR
- Bật máy real-time PCR 15 phút trước khi cho máy chạy. Bật máy tính và khởi động chương trình real-time PCR.
- Thực hiện bước mix với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
- Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.
- Cho chứng +, chứng -, các nồng độ standard, dịch DNA vừa tách (hoặc dịch cDNA vừa thu nhận được (hoặc RNA vừa tách được nếu kít Real-time PCR có chứa phản ứng RT-PCR)) vào từng tube Real-time PCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.
- Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
- Chọn màu cho mẫu, chứng dương, chứng âm, standart theo hướng dẫn của bộ kít sử dụng
- Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động
- Lưu file dữ liệu vào máy tính
- Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
Tai biến và xử trí
- Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường
- Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế hoặc do máy Real-time PCR bị hỏng.
- Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật.