Các bài viết liên quan
- Virus PCR
- Norovirus test nhanh
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) kháng thuốc Bedaquiline MIC trên môi trường thạch
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) kháng thuốc MIC trên môi trường lỏng
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) định danh TB-LAMP
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) kháng INH nồng độ cao môi trường lỏng
- MTB (Mycobacterium tuberculosis) định danh TRCReady
- Vi sinh vật nhiễm khuẩn đường ruột Real-time PCR đa tác nhân
- Vi sinh vật nhiễm khuẩn hô hấp Real-time PCR đa tác nhân
- Vi sinh vật nhiễm khuẩn não-màng não Real-time PCR đa tác nhân
BK virus đo tải lượng Real-time PCR
Quyết định số: 6769/QĐ-BYT
Ngày ban hành: 08/11/2018 12:00
Đại cương
1. Mục đích
Phát hiện và đo số bản sao của virus BK trong dịch não tủy, huyết tương, máu toàn phần hoặc nước tiểu của người.
2. Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.
Chuẩn bị
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)
2.1. Trang thiết bị
- Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
- Máy tách chiết acid nucleic.
- Bộ lưu điện.
- Máy ủ nhiệt.
- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
- Máy ly tâm lạnh ≥ 12000 gpm/phút
- Tủ lạnh 2°C -8°C
- Tủ âm sâu (-20°C) hoặc (-70°C) (nếu có)
- Máy vortex
- Tủ an toàn sinh học
- Micropipettes các thể tích từ 0,5 μl - 1000 μl.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
STT | Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao | Đơn vị |
1 | Khay đựng bệnh phẩm | Cái |
2 | Hộp vận chuyển bệnh phẩm | Cái |
3 | Tube đựng bệnh phẩm 5 ml | Cái |
4 | Cryotube (lưu mẫu dương tính) | Cái |
5 | Sinh phẩm chẩn đoán | Test |
6 | Khấu hao sinh phẩm cho mẫu chứng, mẫu chuẩn và kiểm tra chất lượng | Test |
7 | PCR-Tube 0,1 ml | Cái |
8 | Hóa chất và VTTH cho tách chiết trên MPLC | Test |
9 | Tube eppendorf 1,7 ml | Cái |
10 | Đầu Pipét có lọc 1000 ul | Cái |
11 | Giấy thấm không bụi | Cuộn |
12 | Giấy xét nghiệm | Tờ |
13 | Sổ lưu kết quả xét nghiệm | Quyển |
14 | Bút viết kính | Cái |
15 | Bút bi | Cái |
16 | Mũ giấy | Cái |
17 | Khẩu trang | Cái |
18 | Găng không có bột tal | Đôi |
19 | Găng tay xử lý dụng cụ | Đôi |
20 | Quần áo | Bộ |
21 | Dung dịch xà phòng rửa tay | ml |
22 | Cồn sát trùng tay nhanh | ml |
23 | Dung dịch khử trùng | ml |
24 | Khăn lau tay | Cái |
| Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)* |
|
* Ghi chú:
- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm
Dịch não tủy, huyết tương, máu toàn phần và nước tiểu.
4. Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).
2. Tiến hành kỹ thuật
BK virus PCR Kit (GeneProof - VD hoặc tương đương)
2.1 Thu nhận và xử lí mẫu
Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA nếu cần.
2.2 Tách chiết DNA:
Tách chiết bằng tay hoặc máy tự động.
2.3 Thực hiện phản ứng real-time PCR
Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
- Bật máy real-time PCR. Bật máy tính kh i động chương trình real-time PCR trước khi chạy mẫu ít nhất 15 phút.
- Pha hóa chất:
+ Chuẩn bị đủ số tube PCR cần dùng
+ Cho 30 μl MasterMix vào mỗi tube
+ Nhỏ 10 μl mẫu DNA đã tách chiết từ bệnh phẩm hoặc mẫu chứng dương (gồm 4 nồng độ từ 101 đến 104), chứng âm vào các tube tương ứng. Tổng thể tích cuối cùng là 40 μl.
+ Ly tâm nhẹ ống rồi đặt vào máy real-time PCR theo vị trí đã cài đặt.
- Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
- Chọn màu FAM cho mẫu, chứng dương và chứng âm và HEX cho chứng nội.
- Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động
- Lưu file dữ liệu vào máy tính
- Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
Tai biến và xử trí
1. Sự cố: Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
2. Nguyên nhân: Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
3. Khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.