1. Mục đích

Xác định sự có mặt của RNA đặc trưng của Coronavirus trong mẫu bệnh phẩm của người.

2. Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

1. Người thực hiện

- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học)..

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học tối thiểu cấp 2

- Máy nhiệt

- Máy ly tâm dùng cho ống bệnh phẩm 5ml

- Máy ly tâm ≥ 12000 gpm/phút dùng cho tube 0,2 ml

- Máy vortex

- Máy chạy PCR

- Máy chạy Real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

- Các loại Micropipette điều chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl

- Tủ lạnh thường

- Tủ âm sâu (-20°C) hoặc (-70°C) (nếu có)

- Bộ lưu điện

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

* Ghi chú:

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Chủ yếu là chất tiết đường hô hấp: Ngoáy họng, ngoáy mũi, dịch phế quản, dịch tỵ hầu, đờm. Ngoài ra còn có trong phân, máu, các loại dịch cơ thể nghi ngờ nhiễm coronavirus

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Thu nhận và xử lý mẫu:

- Với các loại dịch nhớt, nhầy, phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết RNA

- Với tăm bông ngoáy họng, ngoáy mũi, cho bệnh phẩm đầu tăm bông vào một tube vô trùng có chứa sẵn 0,5 ml nước Water-DEPC Treated, ngoáy vào thành ống tube ít nhất 05 lần cho bệnh phẩm hòa tan vào dung dịch. Sử dụng dung dịch này để tách chiết RNA.

- Bệnh phẩm đã được thuần nhất có thể lưu giữ -20°C trong 03 tháng nếu chưa được tách chiết.

2.2. Tách chiết RNA

2.3. Chạy phản ứng RT-PCR dùng mồi ngẫu nhiên (Bỏ qua bước này nếu kít sử dụng real-time PCR có chứa luôn phản ứng RT-PCR)

- Bật máy PCR 15 phút trước khi chạy phản ứng RT-PCR

- Thực hiện bước này với các tube RT-PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

- Chỉ lấy đủ số tube RT-PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng RT-PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube.

- Cho dịch RNA tách chiết vào từng tube RT-PCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy PCR.

- Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy PCR hoạt động theo hướng dẫn của bộ kit RT-PCR.

Cho máy PCR chạy chương trình.

2.4 Chạy phản ứng Real-time PCR

- Bật máy real-time PCR 15 phút trước khi cho máy chạy. Bật máy tính và khởi động chương trình real-time PCR.

- Thực hiện bước mix với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

- Chỉ lấy đủ số tube Real-time PCR Mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube.

- Cho chứng +, chứng -, các nồng độ standard, dịch cDNA vừa thu nhận được (hoặc RNA vừa tách được nếu kít Real-time PCR có chứa phản ứng RT- PCR) vào từng tube Real-time PCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.

- Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

- Chọn màu cho mẫu, chứng dương, chứng âm, standart theo hướng dẫn của bộ kít sử dụng

- Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động

- Lưu file dữ liệu vào máy tính

Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

1. Sự cố: Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

2. Nguyên nhân: Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.

3. Khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.