1. Mục đích

Xác định RNA đặc trưng của Zika virus

2. Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time RT - PCR một bước.

1. Người thực hiện

- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1. Trang thiết bị

- Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

- Bộ lưu điện

- Máy ủ nhiệt

- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

- Máy ly tâm lạnh ≥ 12000 gpm/phút

- Tủ lạnh 2°C -8°C

- Tủ âm sâu (-20°C) hoặc (-70°C) (nếu có)

- Máy vortex

- Tủ an toàn sinh học

- Micropipettes và các thể tích từ 0,5 μl - 1000 μl.

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

* Ghi chú:

- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Máu toàn phần, huyết thanh, huyết tương, nước tiểu, mẫu mô và các dịch sinh học khác. Tốt nhất là huyết thanh và nước tiểu.

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

2. Tiến hành kỹ thuật

Bộ sinh phẩm VIASURE Zika, Dengue and Chikungunia Real-time PCR Detection Kit (VD hoặc tương đương)

2.1. Thu nhận và xử lí mẫu

Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết RNA nếu cần.

2.2. Tách chiết RNA: Tách chiết bằng tay hoặc tự động.

2.3. Hồi chỉnh chứng dương

2.3. Thực hiện phản ứng real-time PCR

- Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

- Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Bóc lớp vỏ nhôm che phủ trên đĩa hoặc tube phản ứng.

- Cho dung dịch hồi chỉnh vào mỗi giếng.

- Cho chứng +, chứng - hoặc dịch RNA tách chiết vào từng giếng, đậy nắp, ly tâm nhẹ. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.

- Bật máy real-time PCR. Bật máy tính khởi động chương trình real-time PCR trước khi chạy mẫu ít nhất 15 phút.

- Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

- Chọn màu Cy5 (Zika), FAM (Dengue), ROX (Chikungunya) cho mẫu, chứng dương và chứng âm và HEX (hoặc JOE/VIC) cho chứng nội.

- Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động

- Lưu file dữ liệu vào máy tính

- Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

1. Sự cố: Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

2. Nguyên nhân: Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.

3. Khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.