1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.1. Khái niệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. 

1.2. Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

· Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn. 

· Sắc ký phân bố. 

· Sắc ký ion. 

· Sắc ký rây phân tử. 

Trong đó, sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (< 3000). 

2. Nguyên tắc hoạt động đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion trap)

Mẫu sau khi được tách trong hệ HPLC sẽ đi đến đầu dò MS. Tại đây diễn ra quá trình ion hóa. Ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ phân tích khối, tại đây ion sẽ bị bẫy trong những quỹ đạo được ổn định bởi một điện trường thay đổi theo thời gian. Tùy theo hiệu điện thế âm hay dương mà xác định những ion mang điện tích dương hoặc âm sẽ được dẫn tới bộ phân tích khối. 

Ion cần phân tích sẽ có một tỉ lệ m/z xác định, nhờ đó chúng được tách chọn lọc ra khỏi bộ phân tích khối và tạo một tín hiệu đặc trưng tại hệ thống phát hiện ion. Với khối phổ thu được có thể định danh chính xác hợp chất nghiên cứu và kết hợp với sắc ký đồ tương ứng để định lượng hợp chất ấy. 

Để định lượng một loại thuốc đã biết phục vụ việc điều trị người bệnh. 

Không có chống chỉ với phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ. 

1. Người thực hiện

Kỹ thuật viên xét nghiệm 01 người

2. Phương tiện

Gồm các hóa chất và thiết bị kỹ thuật trong danh sách sau đây:

1                     Nội chuẩn                                                                     0.2 gam

2                      Mẫu chuẩn                                                                    0.2 gam

3                     Dung môi hóa chất chạy máy                                         2 lít

4                     Cột HPLC (các loại)                                                       0.005 cái

5                     Bơm tiêm 5 ml                                                              1 cái

6                     Bơm tiêm 1 ml                                                              2 cái

7                     Kim nhựa                                                                      1 cái

8                     Ống nhựa                                                                     2 cái

9                     Ống nghiệm thủy tinh có nắp vặn (10cm x 13mm)           1 cái

10                     Lọ đựng mẫu (chạy máy HPLC)                                     1 cái

11                     Cột chiết pha rắn                                                          1 cái

12                     Dung môi rửa giải                                                         100 ml

13                     Màng lọc mẫu 0,45um                                                  1 cái

14                     Bình lọc chân không                                                     0.001 cái

15                     Bể siêu âm                                                                   0.001 cái

16                     Lọ đựng dung môi                                                       0.002 cái

17                     Bảo vệ cột HPLC                                                         0.05 cái

18                     Đầu lọc dung môi                                                         0.002 cái

19                     Nước cất                                                                     1 lít

20                     Đèn DAD                                                                     0.004 cái

21                     Dây dẫn dung môi các loại                                            0.001 cái

22                     Dầu chân không                                                           0.01 lít

23                     Dung dịch tune chuẩn máy HPLC                                   0.02 lọ

24                     Máy nén khí 2 cấp                                                        0.001 cái

25                     Máy sắc ký lỏng khối phổ                                              1 máy

26                     Màng lọc dung môi                                                      1 cái

27                     Giấy xét nghiệm, mực in, barcode

28                     Bông

29                     Băng dính

30                     Cồn

31                     Cồn nhanh                                                                   4 ml

32                     Xà phòng rửa tay                                                         2 ml

33                     Găng tay                                                                      2 đôi

34                     Khẩu trang                                                                    1 cái

35                     Mũ phẫu thuật                                                              1 cái

Pha các hóa chất, dung môi cần thiết cho quá trình chiết mẫu và phân tích mẫu. 

3. Hồ sơ

- Tiếp nhận giấy chỉ định kèm theo chữ ký của bác sỹ

- Lưu lại thông tin về người bệnh và bệnh phẩm cũng như phẩn kết quả vào hồ sơ xét nghiệm để hồi cứu

1. Kiểm tra bệnh phẩm

- Đối chiếu thông tin người bệnh (họ tên, tuổi, giới, ngày làm xét nghiệm) ghi trên hộp, lọ đựng bệnh phẩm) trùng với tên người bệnh trên phiếu chỉ định xét nghiệm và trong hồ sơ lưu

- Kiểm tra số lượng và chất lượng bệnh phẩm có thể làm xét nghiệm hay không trước khi tiến hành xử trí mẫu

2. Thực hiện kỹ thuật

Bật máy, cho máy chạy để ổn định hệ thống, đường nền, áp suất chân không của hệ thống khối phổ. Tổng thời gian trung bình để thực hiện định lượng 1 mẫu khoảng 4 giờ. 

2.1. Chiết mẫu

Sử dụng cột chiết pha rắn để chiết mẫu có cho thêm nội chuẩn đã biết trước nồng độ (C-18, C-8, Evidex, …)

Sử dụng MeOH để rửa cột

Sử dụng đệm phosphat để hoạt hóa cột. 

H2O dùng để rửa cột sau khi cho mẫu chạy qua. 

Sau đó cho HCl 0.1N qua cột và rửa cột bằng MeOH. 

Rửa giải chất cần phân tích bằng hệ MeOH: Etylacetat: NH4

Làm khô mẫu bằng khí Nitơ

Chuyển mẫu vào lọ thủy tinh dung tích 2ml, nắp nhựa đậy. 

2.2. Điều kiện chạy HPLC

Cột C-8; C-18. 

Dung môi pha động: Acetonnitril(ACN)

                              Đệm phosphat.

                              MeOH.

                              H2O.

Sau khi máy đã ổn định, đặt mẫu vào máy, cài đặt các thông số, tiến hành phân tích mẫu theo quy trình của chất cần phân tích. 

+/Tốc độ dòng: 0.2 - 2ml/phút

+/Detector UV. 

+/Thể tích bơm mẫu 0,2 - 10mcl

Thiết bị khối phổ Ion trap

Nebuliser         45l/phút

Dry gas           10l/phút

Dry temp         350oC

Với điều kiện sắc ký của thuốc cần phân tích, peak của thuốc cần xác định trong huyết tương được tách hoàn toàn ra khỏi các chất khác, peak cân xứng, thời gian lưu hợp lý ổn định. Sắc ký đồ được tự động ghi lại trên máy tính. 

2.3. Tính kết quả

Nồng độ của chất cần biết được tính dựa theo tỉ lệ của diện tích pic của nội chuẩn. 

3. Đánh giá kết quả

Phổ DAD của chất cần phân tích phải giống phổ của chất chuẩn, có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của chất chuẩn. 

Phổ MS của chất cần phân tích phải có thời gian lưu, m/z trùng với của chất chuẩn

1. Trần Tử An, Nguyễn Văn Tuyền (1984), Bài giảng kiểm nghiệm độc chất, Nhà xuất bản Y học, trang 5-11, 66 - 81. 

2. Đào Trọng Phúc (2005), “Quy trình giao nhận và bảo quản và lưu mẫu, Quy trình xử trí mẫu để tiến hành phân tích giám định”, Danh mục quy trình thường quy, Viện Y học Tư pháp Trung ương, Bộ Y tế. 

3. Nguyễn Đức Luận, Đào Trọng Phúc (1999), Tài liệu lớp tập huấn phân tích độc chất, Khoa Chống độc, Bệnh viện Bạch Mai. 

4. Flanagan R. J. et al (1995), Basic analytical tô xycology, Wordl health organization, p19 - 58. 

5. Clarke E. G. C. (2005), Isolation and Identification of Drugs, The phamaceutical press, 3rd Ed. 

6. Susan Budavari et al (1996), The Merkc Index, Whitehouse Station, 12th Ed. 

7. Pragst F., Herzler M., Herre A., Erxleben B. -T., Rothe M. (2001), UV spectra of tô xyc compounds, Verlag Dr. Dieter Helm, Heppenheim.