Kháng nguyên dsDNA được gắn sẵn trong các giếng nhựa sẽ kết hợp với

kháng thể đặc hiệu anti – dsDNA IgG-IgM (nếu có) trong huyết thanh người bệnh

khi ủ tạo nên phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể đặc hiệu. Sau khi rửa bỏ huyết

thanh thừa, cho chất cộng hợp (còn gọi là conjugate) có bản chất là hỗn hợp anti

IgG và anti IgM người gắn enzym peroxidase. Khi đó cộng hợp sẽ gắn đặc hiệu

vào phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể (nếu có). Sau khi rửa bỏ lượng cộng hợp

dư thừa không gắn với phức hợp Kháng nguyên-Kháng thể, cho tiếp vào giếng

phản ứng một lượng xác định cơ chất TMB/H2O2 . Enzym peroxidase trong giếng

phản ứng (nếu có) sẽ xúc tác tạo phản ứng giữa H2O2 và TMB tạo màu xanh lá

cây. Phản ứng được ngừng lại bằng dung dịch a-xít H2SO4 loãng, lúc này màu xanh

của dung dịch chuyển thành màu vàng chanh, đậm độ màu tương quan thuận với

nồng độ kháng thể IgG và IgM có trong huyết thanh. Xác định mức độ màu bằng

phương pháp đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450 nm hoặc bước sóng kép 450

nm/620 nm.

Các trường hợp nghĩ đến bệnh tự miễn.

Không có chống chỉ định.

1. Người thực hiện

- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;

- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2. Phương tiện – Hóa chất

2.1. Phương tiện

- Máy ly tâm ống máu;

- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl;

- Dàn máy ELISA (tự động hoặc bán tự động);

- Găng tay.

2.2. Hóa chất96

Kít định lượng dsDNA IgG/IgM gồm các thành phần sau:

- Dung dịch pha loãng mẫu;

- Dung dịch rửa;

- Chứng âm (negative control);

- Chứng dương (positive control);

- Chứng ngưỡng (cut-off calibrator);

- Các nồng độ kháng thể chuẩn (calibrator): thường có 6 nồng độ chuẩn,

giá trị cụ thể của các ống nồng độ chuẩn tùy thuộc vào hãng sản xuất;

- Dung dịch cộng hợp (conjugates): 1 lọ cộng hợp IgG và IgM dùng để

phát hiện kháng thể lớp IgG và IgM;

- Cơ chất tạo mầu (TMB substrate);

- Dung dịch dừng phản ứng (stop solution);

- Các giếng phản ứng trên phiến nhựa ELISA;

- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.

3. Mẫu bệnh phẩm

- Mẫu dùng là huyết thanh.

- Cần tách huyết thanh càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu

làm ảnh hưởng đến kết quả phản ứng.

- Nếu có lẫn hồng cầu hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết

thanh thì cần ly tâm mẫu để loại bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm.

- Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ 2oC đến 8oC có thể dùng làm xét

nghiệm trong vòng 7 ngày. Nếu muốn để lâu hơn mới xét nghiệm cần phải bảo

quản ở tủ lạnh sâu (≤ -20oC). Tuy nhiên với mẫu bảo quản lạnh sâu cần tránh

đông-tan nhiều lần.

1. Pha loãng mẫu 100 lần bằng dung dịch pha loãng mẫu.

2. Nhỏ 100µl các nồng độ chuẩn (calibrator), mẫu chứng âm, chứng

dương, và các mẫu thử vào các giếng trên phiến theo sơ đồ định sẵn.

3. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.

4. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.

5. Nhỏ 100µl cộng hợp (conjugate) vào các giếng.

6. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.

7. Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.

8. Nhỏ 100µl cơ chất tạo mầu (TMB subtrate) vào mỗi giếng.97

9. Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.

10. Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng (stop solution) vào mỗi giếng

theo đúng trình tự nhỏ TMB.

11. Ủ tối thiểu 5 phút. Gõ nhẹ vào thành giếng trong 5 giây để trộn đều.

12. Đọc phiến ở bước sóng 450/620 nm (tốt hơn thì dùng bước sóng kép

450/ 620 nm) trong vòng 30 phút sau khi ủ dung dịch ngừng phản ứng.

13. Phân tích kết quả.

- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và

trên ống máu không thống nhất, máu bị đông.

Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thông tin trên giấy chỉ định và

trên ống nghiệm, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

- Sai sót do nhỏ mẫu vào phiến phản ứng không thống nhất thông tin về

thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu phân tích.

Xử trí: Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu

thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi nhỏ mẫu.

- Chứng dương âm tính hoặc chứng âm dương tính: Nếu xảy ra hiện

tượng này đều không dùng được kết quả của lần xét nghiệm này. Nguyên nhân

có thể do hóa chất không đảm bảo chất lượng, do không thực hiện đủ và đúng

các bước trong quy trình xét nghiệm, nhiệt độ phản ứng không phù hợp, thực

hiện bước rửa kém hiệu quả.

Xử trí: làm lại xét nghiệm, kiểm tra chỉ dùng hóa chất còn hạn sử dụng và

được bảo quản đúng điều kiện theo hướng đãn của nhà sản xuất, tuân thủ đúng

các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét nghiệm (25-30oC).

Aesku Diagnostics GmbH. 2007. AESKULISA dsDNA instruction

manual.