Sử dụng phương pháp Real-time-PCR định lượng ARNm của gen ung thư
nhằm mục đích dự đoán thời điểm bệnh tái phát để ngăn chặn trước khi tái phát.
Dựa trên sự kiểm soát lượng huỳnh quang tiêu tốn trong phản ứng có thể xác
định số lượng ARNm của gen ung thư tại thời điểm đó. Đồng thời trong phản
ứng định lượng cùng lúc 2 gen: gen ung thư cần theo dõi và gen tham chiếu
(housekeeping gen - là gen có tốc độ biểu hiện như nhau ở cả tế bào ung thư và
tế bào lành) sẽ cho phép đánh giá mức độ hoạt động của gen ung thư so với gen
tham chiếu ở cùng một thời điểm trong toàn bộ quá trình theo dõi thông qua tỷ
lệ số lượng ARNm của gen ung thư/số lượng ARNm gen tham chiếu. Số lượng
ARNm của gen ung thư tăng dần là đấu hiệu gen ung thư bắt đầu hoạt động trở
lại. 
 

Xét nghiệm này được chỉ định trước và trong suốt quá trình điều trị cho
các người bệnh đang điều trị theo phác đồ nhắm đích. 
 

Không có chống chỉ định. 
 

1. Ngƣời thực hiện
- Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
2.1 Phương tiện
- Hệ thống máy real-time PCR
- Tủ hút hóa chất (chemical fume hood)
- Buồng vô trùng (biology cabinet).
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút).
- Máy vortex.
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl.
- Đầu côn có màng lọc.
183
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza.
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza.
- Tủ lạnh 4-80C, tủ âm sâu -200C.
- Găng tay.
2.2 Hóa chất
- Dung dịch Ficoll hoặc dung dịch ly giải tế bào hồng cầu gồm các muối
MgCl2, Tris-HCl, NaCl.
- Sử dụng kit tách ARN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các
sinh phẩm cần thiết để tách chiết ARN như glycogen, proteinase K, đệm ly giải
tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
- Hóa chất cho phản ứng định lượng biểu hiện gen: kit thương mại. Nếu
không sử dụng kit thương mại thì sử dụng các thành phần riêng lẻ như: Đệm,
MgCl2, dNTPs, enzym phiên mã ngược, enzym kéo dài chuỗi, mồi oligodT hoặc
mồi ngẫu nhiên (random primer), các cặp mồi và probe đặc hiệu, nước khử ion
vô trùng.
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu
xét nghiệm. 
 

1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương chống đông bằng EDTA
2. Tiến hành kỹ thuật
Bƣớc 1: Tách chiết ARN
Xem bài “Tách chiết ARN từ máu ngoại vi/tủy xương
Bƣớc 2: Thực hiện phản ứng ADNc
Sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotit (random hexamer primers) và enzym
Reverse Transcriptase để chuyển hóa ARN thành ADN thông qua các chu trình
nhiệt chuyên biệt.
Bƣớc 3: Thực hiện phản ứng real-time PCR
Chuẩn bị các mẫu chuẩn:
Mỗi loại gen cần định lượng phải có tối thiểu 3 mẫu chuẩn (mẫu chuẩn là
các mẫu ARN đích đã biết trước nồng độ, thường sử dụng mẫu chuẩn ở 3 độ pha
184
loãng liên tiếp) và một mẫu đối chứng âm để kiểm soát ngoại nhiễm (thường sử
dụng H20 đã khử các enzym phân hủy ADN và ARN hoặc đệm Tris- EDTA 1M,
pH=7,5).
Chuẩn bị phản ứng:
- Ghi tên các ống theo thứ tự.
- Mỗi ống phản ứng bổ sung đủ các thành phần phản ứng:
+ Sản phẩm ADNc + master mix theo nồng độ khuyến cáo (nếu sử dụng
kit định lượng chế tạo sẵn).
+ Sản phẩm ADNc + buffer+ enzym+ primer+ probe theo đúng nồng độ
đã tối ưu (nếu sử dụng các thành phần riêng lẻ).
- Đặt các ống phản ứng vào các vị trí trên máy.
Chuẩn bị chương trình trên máy
- Cài đặt sơ đồ giếng theo đúng các vị trí ống đã đặt trên máy, nhập thông
tin mẫu và các nồng độ mẫu chuẩn theo đúng yêu cầu, chọn kênh màu huỳnh
quang tương thích.
- Cài đặt chương trình chạy theo chế độ luân nhiệt khuyến cáo của kit
hoặc chế độ luân nhiệt đã tối ưu được.
- Chọn vị trí lưu kết quả sau khi kết thúc chương trình chạy.
- Bấm start để bắt đầu chạy theo chương trình đã chọn.
Bƣớc 4: Phân tích kết quả
- Sau khi kết thúc chương trình chạy, tất cả các kết quả được hiển thị lên
màn hình.
- Kiểm tra các đường chuẩn và mẫu đối chứng âm trước.
+ Nếu đạt yêu cầu (theo hướng dẫn của kit sử dụng hoặc theo kết quả lý
thuyết đã tối ưu) thì tiếp tục phân tích các mẫu khác theo kết quả thu được.
+ Nếu không đạt yêu cầu (mẫu chuẩn không có tín hiệu huỳnh quang,
mẫu đối chứng âm bị nhiễm thành dương tính….) thì không đủ cơ sở để phân
tích các mẫu khác. Trong trường hợp này phải lặp lại xét nghiệm sau khi đã tìm
ra nguyên nhân sai sót ở xét nghiệm trước. 
 

1. Phạm Hùng Vân (2009). Real-time PCR. PCR và Realtime PCR - các vấn đề
cơ bản và các áp dụng thường gặp. Nhà xuất bản y học, trang 60-65.
2. J Gabert et at (2003). Standardization and quality control studies of “realtime” quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene
transcripts for residual disease detection in leukemia - A Europe Agains Cancer
. Leukemia 17, 2318-2357.