Phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) là phản ứng cho phép nhân bản chính xác
một trình tự ADN quan tâm lên hàng triệu lần. Sử dụng phương pháp PCR thông
thường với một cặp mồi đặc trưng chỉ phát hiện được một đột biến. Để phát hiện
nhiều hơn một đột biến sẽ phải làm nhiều xét nghiệm PCR. Vì vậy, trong trường
hợp bệnh do nhiều đột biến và cần xác định các đột biến này thì nên sử dụng kỹ
Multiplex PCR. Đây là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một
phản ứng PCR cho phép phát hiện được đồng thời nhiều đột biến. 
 

Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả các người bệnh mắc bệnh máu
do các đột biến gen. 

 

Không có chống chỉ định. 
 

1. Người thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm Sinh học phân tử đã được đào tạo.
2. Phương tiện - Hóa chất
2.1. Phương tiện
- Máy PCR;
- Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp
ảnh;
- Buồng vô trùng (biology cabinet);
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
- Máy vortex;
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
- Đầu côn có màng lọc;
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Tủ lạnh 4-8oC, tủ âm sâu -20oC;
- Găng tay.
2.2. Hóa chất
- Kit tách ADN thương mại hoặc các hóa chất cần thiết cho tách chiết thủ
công ADN (proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối).
- Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi,
nước khử ion vô trùng.
- Các cặp mồi đặc hiệu cho các đột biến cần xác định và 1 cặp mồi sử
dụng làm chứng nội kiểm (Internal control).
- Thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN.
- Thuốc nhuộm ethidium bromide.
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu
xét nghiệm.
 

1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.
2. Tiến hành kỹ thuật
Bước 1. Tách chiết ADN
Xem bài “Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”
Bước 2. Thực hiện phản ứng Multiplex PCR
- Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để
rã đông hoàn toàn.
- Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống 0,2 ml: Buffer, dNTPs, MgCl2
(nếu trong Buffer chưa có), hỗn hợp mồi (gồm các cặp mồi phát hiện đột biến
được trộn theo tỷ lệ nhất định), enzym Taq polymerase, nước khử ion vô trùng,
ADN khuôn.
- Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn.
- Đặt vào máy PCR.
- Chọn chương trình.
- Bấm start để máy chạy.
Bước 3: Điện di sản phẩm PCR
Chuẩn bị gel agarose:
- Cân 1 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt.
- Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X...) vào bình, lắc đều.
- Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn.
- Để ấm đến 600 rồi đổ vào khay đã cắm lược.
- Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra.
Điện di:
- Lấy 5 µl sản phẩm PCR + 1 µl đệm tra mẫu + 4 µl dH20
- Trộn đều và nhỏ vào các giếng theo thứ tự
- Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp
- Đặt bản gel vào máy điện di
- Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở 100 V trong 20 phút
- Nhuộm bản gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 phút 
 

1. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997). Các phương pháp tách chiết axit
nucleic. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, trang 124-125.
2. A.Rolfs et at (1992). PCR:Clinical Diagnosis and Research. Springer Verlag,
Berlin.