Phát hiện đột biến JAK2 V617F (Janus Kinase Valin 617 Phenylalamin)
trong các mẫu bệnh phẩm của người mắc hội chứng tăng sinh tủy mạn để góp
phần chẩn đoán, xếp loại các bệnh đa hồng cầu nguyên phát, tăng tiểu cầu tiên
phát, xơ tủy nguyên phát phục vụ cho điều trị bệnh.
Đột biến JAK2 V617F được phát hiện bằng kỹ thuật Allen-specific PCR
(AS-PCR). Trong Allen-specific PCR (AS-PCR) người ta thiết kế một đoạn
primer có trình tự sai khác so với trình tự đặc hiệu một nucleotide ở đầu 3’ để
ngăn cản quá trình kéo dài chuỗi ADN của enzym Taq-polymeraza trong phản
ứng PCR. Trong phương pháp này, người ta thiết kế hai ống phản PCR song
song: ống phản thứ nhất sử dụng cặp primer đặc hiệu cho allen bình thường, ống
phản ứng thứ hai sử dụng cặp primer để nhân bản allen đột biến. Phản ứng ASPCR luôn có ít nhất một sản phẩm: nếu người bệnh dị hợp tử thì trong hai ống
phản ứng PCR đều có một băng sản phẩm đặc hiệu, nếu người bệnh đồng hợp tử
mang gen bệnh thì chỉ có ống phản ứng 2 có băng đặc hiệu, còn người bệnh
đồng hợp tử bình thường thì chỉ ống phản ứng 1 có băng sản phẩm đặc hiệu. 
 

Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả các người bệnh thuộc hội chứng
tăng sinh tủy mạn. 
 

Không có chống chỉ định. 
 

1. Người thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.
2. Phương tiện - Hóa chất
2.1 Phương tiện
- Máy PCR
- Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp
ảnh.
- Buồng vô trùng (biology cabinet).
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút).
- Máy vortex.
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl.
- Đầu côn có màng lọc.
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza.
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza.
- Tủ lạnh 4-80C, tủ âm sâu -20oC.
- Găng tay.
2.2 Hóa chất
- Sử dụng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các
sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào,
phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
- Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi,
nước khử ion vô trùng, các cặp mồi đặc hiệu.
- Hóa chất điện di: thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN, thuốc
nhuộm ethidium bromide.
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu
xét nghiệm. 

 

1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu toàn phần đựng trong ống chống đông EDTA.
2. Tiến hành kỹ thuật
Bƣớc 1: Tách chiết ADN
Xem bài “Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”.
Bƣớc 2: Thực hiện phản ứng AS-PCR
- Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để
rã đông hoàn toàn.
- Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống 0,2 ml:
 

192
 

(x: thể tích ADN đạt nồng độ 100 ng)
- Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn
- Đặt vào máy PCR
- Chọn chương trình
- Bấm start để máy chạy.
Bƣớc 3: Điện di sản phẩm PCR
Chuẩn bị gel agarose:
- Cân 1 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt.
- Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X...) vào bình, lắc đều.
- Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn.
- Để ấm đến 600 rồi đổ vào khay đã cắm lược.
- Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra.
Điện di:
- Lấy 5 µl sản phẩm PCR + 1 µl đệm tra mẫu 6X + 4 µl dH20
- Trộn đều và nhỏ vào các giếng theo thứ tự
- Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp
- Đặt bản gel vào máy điện di
- Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở 100 V trong 20 phút
- Nhuộm bản gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 phút 
 

193
 

1. A.Rolfs et at (1992). PCR:Clinical Diagnosis and Research. Springer
Verlag, Berlin.
2. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ et at. Acquired mutation of the
tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet
2005; 365:1054-61.