Tế bào gốc tạo máu có kháng nguyên CD34 trên bề mặt. Nếu ủ kháng thể

anti CD34 với mẫu bệnh phẩm có tế bào gốc tạo máu, kháng thể này sẽ gắn đặc

hiệu lên bề mặt các tế bào gốc tạo máu mang CD34. Dùng kỹ thuật miễn dịch

huỳnh quang phân tích trên máy phân tích tế bào dòng chảy (flow cytometer) có

thể đếm chính xác số lượng và tỷ lệ % tế bào gốc tạo máu CD34 trong mẫu bệnh

phẩm.

Các trường hợp cần đếm số lượng tế bào gốc tạo máu CD34+.

Không có chống chỉ định.

1. Ngƣời thực hiện

- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;

- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2. Phƣơng tiện - Hóa chất

2.1. Phương tiện

- Máy phân tích tế bào dòng chảy (có thể phân tích các kênh màu huỳnh

quang 7ADD, FITC và PE).

- Máy ly tâm ống máu.

- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl.

- Găng tay.

2.2. Hóa chất

- Bộ kít đếm CD34 gồm có các hóa chất sau: 7AAD, CD45-FITC/CD34-

PE, CD45-FITC/Isotype Control-PE, hạt tham chiếu (có nồng độ xác định),

dung dịch ly giải hồng cầu.

- Các dung dịch chạy máy và dung dịch rửa máy để vận hành máy phân

tích tế bào dòng chảy;

- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.

3. Bệnh phẩm110

Bệnh phẩm có thể là mẫu máu ngoại vi, mẫu máu cuống rốn, mẫu lấy từ

khối tế bào gốc máu ngoại vi tươi hoặc khối tế bào gốc máu ngoại vi đông lạnh

sau rã đông, hoặc mẫu dịch hút tủy xương.

1. Lấy bệnh phẩm

- Lấy tối thiểu 0,5 ml mẫu bệnh phẩm. Nếu mẫu bệnh phẩm là máu ngoại

vi thì chống đông bằng EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid). Mẫu bệnh

phẩm đảm bảo chất lượng là mẫu bệnh phẩm không đông vón và không lâu quá

1 giờ sau khi lấy khỏi tĩnh mạch hoặc sau khi rã đông.

2. Tiến hành kỹ thuật

- Đếm số lượng bạch cầu có trong mẫu thử, pha loãng mẫu thử về nồng độ

10×109 tế bào/lít, ghi lại hệ số pha loãng (số lần pha loãng).

- Lấy 100 ul mẫu thử đã pha loãng cho vào các ống 1, 2 và 3.

- Thêm 20 µl 7AAD vào cả 3 ống 1, 2, 3.

- Thêm 20 µl CD45-FITC/CD34-PE vào ống 1 và ống 2.

- Thêm 20 µl Control (CD45-FITC/Isotype PE) vào ống số 3.

- Votex đều các ống và ủ nhiệt độ phòng trong 20 phút, tránh ánh sáng.

- Thêm 2000 µl dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng 10 phút.

- Ngay lập tức thêm 100 ul huyền dịch hạt tham chiếu vào các ống 1, 2, 3.

- Trộn lắc đều các ống.

- Phân tích flow cytometry bằng chương trình đếm CD34 có sẵn trên máy

flow cytometry.

- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống

mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.111

Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu

bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

- Đặt nhầm vị trí giữa mẫu chứng âm (Isotype Control) với các mẫu thử.

Xử trí: kiểm tra đối chiếu vị trí đặt ống đúng thứ tự trước khi phân tích

- Máy chỉ cho ra kết quả CD34%, không tính ra được kết quả tế bào

CD34/ µl. Thường do quên không nhập trị số nồng độ hạt tham chiếu vào phần

mềm.

Xử trí: Chạy máy phân tích lại (không cần ủ lại mẫu), kiểm tra xác định

đã nhập trị số nồng độ hạt tham chiếu trước khi phân tích trên máy.

Beckman Coulter. 2011. Haematopoietic Stem Cell CD34+ Enumeration Kit

Instruction Manual.