Bệnh nhân có thể đã mẫn cảm với các kháng nguyên hệ HLA đồng loài từ

trước hoặc bị mẫn cảm với kháng nguyên hệ HLA trong quá trình điều trị trước

ghép đồng loài (ghép tạng hoặc ghép tế bào gốc tạo máu). Khi đó trong máu

bệnh nhân có thể sẽ hình thành các kháng thể miễn dịch đặc hiệu chống lại HLA

đã mẫn cảm. Nếu trong máu bệnh nhân ghép có kháng thể đặc hiệu chống lại

HLA người cho thì kết quả sau ghép rất xấu, thường bị thải ghép tối cấp. Để

tránh tình trạng thải ghép tối cấp, trước khi ghép cần làm xét nghiệm đọ chéo

nhằm phát hiện trong máu bệnh nhân dự kiến ghép có kháng thể đặc hiệu kháng

lại HLA người cho hay không. Kháng nguyên hệ HLA có 2 lớp, HLA lớp 1 và

HLA lớp 2. HLA lớp 1 xuất hiện trên bề mặt tất cả các tế bào có nhân, HLA lớp

2 có mặt chủ yếu trên các tế bào lympho B, tế bào mono, và tế bào tua gai

(dendritic cell). Do vậy nếu ủ huyết thanh bệnh nhân (người nhận) với lympho

người cho, kháng thể đặc hiệu HLA lớp 1 và/hoặc lớp 2 (nếu có) sẽ gắn lên bề

mặt tế bào lympho (lympho T và/hoặc lympho B) người cho. Xét nghiệm đọ

chéo lympho dùng để phát hiện kháng thể kháng HLA của người nhận ghép

trong lựa chọn người cho, trong theo dõi phản ứng sau ghép. Để xét nghiệm đọ

chéo lympho trước kia người ta hay dùng kỹ thuật vi độc tế bào lympho. Tuy

nhiên hiện nay do tính ưu việt về độ nhạy, độ chính xác, và tốc độ phân tích, kỹ

thuật phân tích tế bào dòng chảy được dùng nhiều hơn.

Bệnh nhân trước ghép và sau ghép tạng, ghép tủy.

Không có chống chỉ định.

1. Ngƣời thực hiện

- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;

- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2. Phƣơng tiện - Hóa chất113

2.1. Phương tiện

- Máy phân tích tế bào dòng chảy (4 màu huỳnh quang trở lên);

- Máy ly tâm ống máu;

- Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl;

- Các ống vi ly tâm (ống Eppendorf)1,5 ml.

- Găng tay.

2.2. Hóa chất

- Dung dịch đệm PBS;

- Hỗn hợp kháng thể CD45/CD3/CD19/anti Human IgG, mỗi loại kháng

thể gắn 1 màu huỳnh quang khác nhau;

- Dung dịch ly giải hồng cầu;

- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.

3. Bệnh phẩm

Bệnh phẩm cần lấy là mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân và của người cho.

1. Lấy bệnh phẩm

- Lấy 2 ml máu chống đông bằng EDTA của người cho.

- Lấy 2 ml máu đông của bệnh nhân và 2 ml máu đông của người cho.

2. Tiến hành kỹ thuật

- Chuẩn bị tế bào người cho:

+ Lấy 100 µl máu toàn phần người cho vào mỗi ống vi ly tâm 1,5 ml (cần

làm 2 ống).

+ Thêm 1000 µl dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng 10 phút.

+ Ly tâm 3000 vòng/phút x 3 phút, đổ bỏ dịch nổi, giữ cặn tế bào.

+ Thêm 1 ml dung dịch PBS, tái huyền dịch cặn tế bào, ly tâm rửa 3000

vòng/phút x 3 phút, đổ bỏ dịch nổi

- Chuẩn bị huyết thanh bệnh nhân và huyết thanh người cho: ly tâm ống

máu đông, tách huyết thanh.

- Ủ huyết thanh bệnh nhân hoặc huyết thanh người cho với tế bào người

cho.

+ Nhỏ 100 µl huyết thanh bệnh nhân hoặc huyết thanh người cho vào các

ống Eppendorf chứa tế bào người cho. Trộn đều và ủ 37oC trong 1 giờ. Ống ủ

huyết thành bệnh nhân với tế bào người cho là ống thử phát hiện kháng thể

kháng HLA, ống ủ huyết thanh người cho với tế bào người cho là ống tự chứng.114

+ Thêm 1 ml PBS, trộn đều trong 15 giây. Ly tâm 3000 vòng/phút x 3

phút. Hút bỏ dịch nổi. Lặp lại quy trình trên 2 lần

- Ủ kháng thể: Nhỏ 20 µl hỗn hợp kháng thể anti CD45/anti CD3/anti

CD19/anti human IgG, ủ 20 phút nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.

- Phân tích: Phân tích flow cytometry bằng chương trình Cross match đã

lập sẵn trên máy flow cytometry.

- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống

mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.

Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu

bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

- Các vùng tế bào lympho không nằm trong cửa sổ chương trình chạy.

Nguyên nhân có thể do thực hiện không đúng, lượng kháng thể ủ không đủ, thực

hiện không đủ các bước của quy trình, ủ không đủ thời gian, hút pipet không tốt,

tắc kim hút trên máy…

Xử trí: Làm lại xét nghiệm và tuân thủ theo đúng quy trình. Kiểm tra máy

trước khi phân tích, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo

hướng dẫn đi theo máy.

1. Harmer A.W., Garner S., Bell A.E. et al. 1996. Evaluation of the flow

cytometric crossmatch. Preliminary results of a multicentre study.

Transplantation 61, 1108-11.

2. Beckman Coulter. 2011. IOTest CD45 Used manual115

3. Beckman Coulter. 2011. IOTest CD3 Used manual

4. Beckman Coulter. 2011. IOTest CD19 Used manual

5. Beckman Coulter. 2011. IOTest Human IgG Used manual