- Đái huyết sắc tố kích phát ban đêm là một bệnh rối loạn tế bào gốc tạo

máu. Đột biến xảy ra ở tế bào gốc tạo máu làm mất gen GPI-A, gen này tổng

hợp protein gắn màng glycosyl-phosphatidylinositol (GPI). Do mất hoặc thiếu

hụt các GPI nên các protein gắn màng (như CD55, CD59) gắn ít hoặc không gắn

được lên màng tế bào hồng cầu do vậy không bảo vệ được tế bào trước sự tấn

công của bổ thể, dẫn tới các tế bào hồng cầu dễ bị hoạt hóa bởi bổ thể và gây vỡ

hồng cầu.

- Trên phân tích tế bào dòng chảy, tế bào máu ngoại vi ủ với anti CD45

sau ly giải hồng cầu sẽ phân bổ thành 3 vùng quần thể rõ rệt: vùng bạch cầu hạt,

vùng mono, và vùng lympho.

- Dựa trên các đặc tính này, kỹ thuật flow cytometry sử dụng các kháng

thể đặc hiệu gắn huỳnh quang để phát hiện sự có mặt, thiếu hụt, hoặc mất các

thụ thể CD55 và/hoặc CD59 trên các quần thể tế bào bạch cầu. Từ đó góp phần

chẩn đoán xác định bệnh đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm.

Suy tủy xương, nghĩ đến bệnh đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm.

Không có chống chỉ định.

1. Ngƣời thực hiện

- Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;

- Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2. Phƣơng tiện, hóa chất.

2.1. Phương tiện

- Máy phân tích tế bào dòng chảy (máy flow cytometer);

- Máy ly tâm;

- Máy lắc trộn;

- Pipet man và đầu pipet loại 250 µl và 1000 µl;

- Ống nghiệm flow cytometry (chuyên dụng cho máy phân tích tế bào

dòng chảy).

- Găng tay.120

2.2. Hóa chất

- Anti CD45-PC5;

- Anti CD55-PE;

- Anti CD59-FITC;

- Dung dịch ly giải hồng cầu;

- Dung dịch sheath chạy máy flow;

- Dung dịch đệm PBS.

- Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.

3. Bệnh phẩm

- Là mẫu máu ngoại vi chống đông bằng EDTA. Mẫu được lấy từ các

người bệnh nghi ngờ đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm và người bệnh có hội

chứng rối loạn sinh tủy.

1. Lấy bệnh phẩm

- 2ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA;

- Mẫu cần được ủ kháng thể ngay trong vòng 6 giờ sau lấy mẫu.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Chuẩn bị mẫu

- Lấy 100 µl máu cho vào 1 ống nghiệm flow cytometry.

- Ly giải hồng cầu bằng 1 ml dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng

trong 10 phút.

- Ly tâm rửa huyền dịch tế bào sau ly giải hồng cầu 2 lần, mỗi làn làm

như sau: thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn lắc đều và ly

tâm 2000 vòng/phút trong 3 phút. Đổ bỏ dịch nổi, để lại cặn tế bào và lượng

dịch còn lại (khoảng 100 µl). Trộn đều cặn và lượng dịch còn lại.

2.2. Ủ kháng thể

- Cho kháng thể anti CD45-PC5, anti CD55-PE, anti CD59-FITC (mỗi

loại 20 l) vào ống flow cytometry chứa cặn tế bào đã phá hồng cầu ở bước trên.

Trộn đều và ủ nhiệt độ phòng 20 phút, tránh ánh sáng.

- Rửa bỏ kháng thể thừa: sau ủ, thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow

cytometry, trộn đều và ly tâm 2000 vòng/phút trong 3 phút. Đổ bỏ dịch nổi, để

lại cặn tế bào.

- Thêm 1 ml PBS vào ống cặn tế bào, trộn đều. Lúc này ống đã sẵn sàng

cho phân tích.121

2.3. Phân tích CD55, CD59 bạch cầu trên máy flow cytometry

- Đưa ống flow cytometry vào vị trí đọc trên máy.

- Mở chương trình phân tích CD55, CD59 bạch cầu đã lập sẵn trên máy.

Nhập vị trí ống phân tích và chạy chương trình phần mềm phân tích.

- Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống

mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.

Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu

bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

- Các tế bào bạch cầu nằm không đúng vùng tế bào trong cửa sổ chương

trình chạy. Nguyên nhân có thể do thực hiện không đúng, lượng kháng thể ủ

không đủ, thực hiện không đủ các bước của quy trình, ủ không đủ thời gian, hút

pipet không tốt, tắc kim hút trên máy…

Xử trí: Làm lại xét nghiệm và tuân thủ theo đúng quy trình. Kiểm tra máy

trước khi phân tích, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo

hướng dẫn đi theo máy.

1. Beckman Coulter. 2011. IOTest CD45-PC5 Used manual.

2. Beckman Coulter. 2011. IOTest CD55-PE Used manual.

3. Beckman Coulter. 2011. IOTest CD59-FITC Used manual.