Kỹ thuật FISH được tiến hành dựa trên cơ sở của phản ứng lai ghép. Trong

tế bào, phân tử ADN tồn tại dưới dạng phân tử kép gồm 2 chuỗi đơn gắn kết bổ

sung với nhau thông qua liên kết hydro. Liên kết hydro là liên kết yếu nên dễ dàng

bị đứt gãy dưới tác động của nhiệt độ hay pH cao. Lúc đó, phân tử ADN bị tách

thành 2 chuỗi đơn. Tuy nhiên khi nhiệt độ hay pH giảm, các chuỗi đơn lại ghép

nhau theo nguyên tắc bổ sung.

Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH sử dụng các probe là đoạn ADN đặc

hiệu có gắn huỳnh quang để lai ghép với các đoạn ADN tương đồng trên nhiễm

sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bất thường nhiễm sắc thể một cách

chính xác và nhanh chóng.

Xét nghiệm này được chỉ định ở giai đoạn chẩn đoán bệnh hoặc giai đoạn

theo dõi điều trị bệnh cho tất cả người bệnh mắc bệnh máu ác tính liên quan đến

các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu.

Không có chống chỉ định.

1. Ngƣời thực hiện

Kỹ thuật viên xét nghiệm Di truyền - Sinh học phân tử đã được đào tạo.

2. Phƣơng tiện, hóa chất

2.1. Phương tiện

- Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, và kính hiển vi

huỳnh quang;

- Dụng cụ: kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22,

pipetman 100 μl, 10 μl, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.

2.2. Hóa chất

- Probe phù hợp tương ứng với đoạn gen cần phát hiện;

- Dung dịch 10% formamide: 5 ml formamide + 30 ml H2O + 15 ml 20X

SSC;132

- Dung dịch 2X SSC;

- Dung dịch rửa 0,1% NP40: 2X SSC + 0,1% NP40;

- Dung dịch rửa 0,3% NP-40: 0,4X SSC + 0,3% NP40;

- Cồn 70o, 85o, 100o.

3. Bệnh phẩm

2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có

tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml.

1. Lấy bệnh phẩm

- 2ml máu ngoại vi hoặc dịch hút tủy xương được đựng trong bơm tiêm có

tráng chất chống đông heparin 5.000 đơn vị/ml. Máu hoặc tủy xương được nuôi

cấy trong 24 giờ.

- Sau 24 giờ, tiến hành thu hoạch huyền dịch tế bào.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Chuẩn bị tiêu bản

- Nếu sử dụng kỹ thuật FISH trên các cụm kỳ giữa (metaphase) thì cần

nuôi cấy và chuẩn bị tiêu bản như kỹ thuật xét nghiệm công thức nhiễm sắc thể.

Trong trường hợp sử dụng trên nhân tế bào thì có thể bỏ qua bước nuôi cấy.

- Nhỏ huyền dịch tế bào lên tiêu bản.

Yêu cầu: hình thái nhân rõ ràng, tế bào dàn đều, các cụm nhiễm sắc thể kỳ

giữa to và bung đẹp.

- Dùng bút kim cương đánh dấu trên bề mặt tiêu bản những vùng đáp ứng

được yêu cầu trên.

2.2. Rửa tiêu bản

- Ngâm tiêu bản vào dung dịch 2X SSC ở 37±1oC trong 15 phút;

- Rửa tiêu bản qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ phòng trong 5

phút;

- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa dung dịch formaldehyde 10% ở nhiệt độ

phòng trong 5 phút;

- Rửa tiêu bản qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ phòng trong 5

phút;

- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồn 70o trong 1 phút;

- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồn 85o trong 1 phút;

- Chuyển tiêu bản qua cóng chứa cồn 100o trong 1 phút;133

- Để tiêu bản khô hoàn toàn ở nhiệt độ phòng.

2.3. Chuẩn bị probe

- Trộn đều các dung dịch sau trong 1 ống PCR (1 μl probe + 7 μl LSI + 2

μl dH2O) /1tiêu bản.

- Ly tâm nhẹ.

2.4. Lai

- Nhỏ 10 μl dung dịch probe vào khu vực đánh dấu trên tiêu bản sau đó

che phủ bằng coverslip.

Yêu cầu: dung dịch probe thấm đều trên tiêu bản, không có bọt khí.

- Phủ kín coverslip bằng cao su xi măng.

- Đặt tiêu bản vào máy lai, chọn chương trình biến tính ở 73oC trong 3

phút và ủ 37oC trong 16 - 20 giờ.

2.5. Rửa sau khi lai

- Gỡ bỏ xi măng cao su và coverslip;

- Ngâm và lắc mạnh tiêu bản lần lượt qua các cóng Coplin sau.

+ Dung dịch (0,4X SSC/ 0.3% NP40): 2 phút, 73oC;

+ Dung dịch (2X SSC/ 0,1% NP40): 1phút, nhiệt độ phòng.

- Làm khô tiêu bản.

2.6. Chống mất màu probe

- Nhỏ 10-20 μl dung dịch DAPI/antifade (1:20) lên bề mặt tiêu bản để

chống mất màu probe và nhuộm nhân tế bào.

- Phủ kín tiêu bản bằng coverslip.

Yêu cầu: dung dịch dàn đều trên tiêu bản và không có bọt khí

Vấn đề Nguyên nhân Cách khắc phục

Không có

tín hiệu

hoặc tín

hiệu yếu

Kính hiển vi không thích hợp

hoặc có sự cố Kiểm tra lại kính và các vật kính

Probe không biến tính hoàn toàn Kiểm tra nhiệt độ bể ấm có đúng

(73+/-1)oC

Điều kiện lai không thích hợp

Kiểm tra nhiệt độ tủ ấm có đúng 37oC

hay không.

Tăng thời gian lai lên 1giờ.

Điều kiện rửa không thích hợp

Kiểm tra nhiệt độ bể ấm có đúng 73oC

Kiểm tra các thành phần dung dịch

rửa (pH…)

Xuất hiện bọt khí giữa tiêu bản

và coverslip

Loại bỏ bọt khí

Bảo quản probe không đúng

cách

Bảo quản probe ở -20oC, không ánh

sang

Tín hiệu Điều kiện lai không thích hợp Kiểm tra nhiệt đổ tủ ấm có đúng 37oC135

đặc trưng

yếu Nhiệt độ dung dịch rửa quá thấp Duy trì nhiệt độ dung dịch rửa ở (73+/-1)oC

Nền quá

bẩn

Tiêu bản làm già quá mức cho

phép hoặc chứa nhiều tế bào chất

Tăng thời gian biến tính của tiêu bản

lên 10 phút

Tiêu bản không sạch hoặc nhiều

mảnh vỡ tế bào trên tiêu bản Chuẩn bị lại tiêu bản

Các mảnh ADN không sạch

Thực hiện lại bước rửa tiêu bản sau

khi lai với formamide

Dung dịch rửa sai thành phần và

nhiệt độ

Kiểm tra lại dung dịch rửa

Hình thái

các nhiễm

sắc thể bị

co cụm,

biến dạng

Để tiêu bản bị quá khô Tăng độ ẩm hoặc tăng nhiệt độ bể ấm

trong quá trình tiến hành thí nghiệm

Tiêu bản chưa được sấy khô

trước khi biến tính

Chuẩn bị lại xét nghiệm với tiêu bản

mới

Làm già tiêu bản trước khi tiến hành

FISH 24 giờ

Tiêu bản chưa khô sau biến tính Sấy tiêu bản ở nhiệt độ 45oC trong 10-

15 phút sau biến tính

Nhiệt độ bể ấm quá cao Kiểm tra nhiệt độ bể ấm có đúng

(73+/-1)oC

Thời gian biến tính quá lâu Giảm thời gian biến tính 1 phút

Tín hiệu

quá mạnh

Nồng độ probe sử dụng quá cao

so với dải màu của KHV

Cố gắng chỉnh kính thay thế bằng các

dải màu trung lập

1. Tài liệu hướng dẫn sử dụng của công ty Vysis.

2. Lynda J. Cambell, ( 2011), “Cancer cytogenetic”, Human Press.