Tính đa hình (polymorphism) của một số đoạn gen là hiện tượng khác
nhau một hoặc một nhóm nucleotid ở một vị trí nhất định trên gen nhưng không
làm thay đổi hoạt động của gen. Các đa hình này thường nằm trong trình tự nhận
biết của một hoặc một số enzym giới hạn và có thể được phát hiện khi sử dụng
kỹ thuật PCR-RFLP. Xác định đa hình đặc trưng ở người bệnh hemophilia, sau
đó sử dụng đa hình này để tìm kiếm cá thể mang gen trong gia đình dựa trên
nguyên tắc các gen nằm gần nhau thì di truyền cùng nhau. Đầu tiên, sử dụng kỹ
thuật PCR để nhân bản đoạn gen quan tâm có chứa gen đa hình, sau đó cắt sản
phẩm PCR này với một enzym giới hạn đặc hiệu với vị trí đa hình. Quan sát các
sản phẩm cắt, sẽ nhận dạng được gen.
Yêu cầu để thực hiện kỹ thuật:
+ Phải biết người mẹ là người chắc chắn mang gen hemophilia (carrier)
và cần phải xét nghiệm đặc tính đa hình của gen ở người mẹ, người mẹ phải là
người dị hợp tử với đặc tính đa hình.
+ Phải xét nghiệm đặc tính đa hình của bố và của người bệnh hemophilia
(là anh trai hoặc em trai của người cần phát hiện hoặc người bệnh là một người
nam giới liên quan khác như bác ruột về phía mẹ). 
 

Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả những người phụ nữ trong gia
đình có tiền sử mắc bệnh Hemophilia mà có nhu cầu xác định tình trạng mang
gen. 
 

Không có chống chỉ định. 
 

1. Ngƣời thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.
2. Phƣơng tiện - Hóa chất
152
2.1. Phương tiện
- Máy PCR;
- Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp
ảnh;
- Buồng vô trùng (biology cabinet);
- Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
- Máy vortex;
- Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
- Đầu côn có màng lọc;
- Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
- Tủ lạnh 4-8oC, tủ âm sâu -200C;
- Găng tay.
2.2 Hóa chất
- Sử dụng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các
sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào,
phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
- Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi,
nước khử ion vô trùng, các cặp mồi đặc hiệu.
- Hóa chất điện di: thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN, thuốc
nhuộm ethidium bromide.
3. Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi (của mỗi thành viên) đựng trong ống chống đông
EDTA.
4. Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu
xét nghiệm.
 

1. Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi (của mỗi thành viên) đựng trong ống chống đông
EDTA.
2. Tiến hành kỹ thuật
Bƣớc 1: Tách chiết ADN
Xem bài “ Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”.
153
Bƣớc 2: PCR
- Thực hiện phản ứng PCR với sự tham gia của các thành phần sau:
PCR buffer 10X 5 µl
ADN 100 ng
Forward primer (10pM) 1 µl
Reverse primer (10pM) 1 µl
Taq-polymerase 0.5 U
H20 đủ thể tích 50 µl
Bƣớc 3: Cắt với enzym giới hạn
Thực hiện phản ứng cắt bằng enzym giới hạn với các thành phần sau:
Đệm phù hợp với enzym giới hạn 3 µl
Sản phẩm PCR 20-25 µl
Enzym giới hạn 2 µl
H20 đủ thể tích 30 µl
Bƣớc 4: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt
Sử dụng 20-25 µl sản phẩm cắt cùng với 10 µl sản phẩm PCR và thang
ADN chuẩn (marker) điện di trên gel agarose. Tùy thuộc kích thước đoạn gen
cần quan sát mà chọn nồng độ gel agarose và thời gian chạy điện di thích hợp.
Sau đó kết quả được đọc và phân tích thông qua hình ảnh soi trên đèn UV.
 

1. D J Bowen. Haemophilia A and Haemophilia B: molecular insights. J
Clin Pathol: Mol Pathol 2002; 55:1-8
2. Keeney S et al. The molecular analysis of haemophilia A: a guideline
from the UK Haemophilia Centre Doctors' Organization Haemophilia
Genetics Laboratory Network. Haemophilia 2005; 11: 387-97